南京大学生化实验一：总糖和还原糖含量的测定

1、总糖和还原糖含量的测定实验报告实验目的 : 植物体内的还原糖，主要是葡萄糖、果糖和麦芽糖。它们在植物体内的分布，不仅反映植物体内碳水化合物的运转情况，而且也是呼吸作用的基质。还原糖还能形成其他物质如有机酸等。此外，水果蔬菜中糖量的多少，也是坚定其品质的重要指标。还原糖在有机体的代谢中起着重要的作用，其他碳水化合物，如淀粉蔗糖等，经水解也生成还原糖。通过本实验，掌握还原糖定量测定的基本原理，练习比色定糖法的基本操作，热悉分光光度计的使用方法。 实验原理：1. 还原糖还原糖是具有还原性的糖类的统称。分子中含有游离醛基或者酮基的单糖和含有游离醛基的二糖都具有还原性。如葡糖糖、果糖、半乳糖、乳糖、阿拉

2、伯糖、麦芽糖等。2. 美拉德反应美拉德反应广泛分布于食品工业中的非酶褐变反应：还原糖与氨基酸/蛋白质在加热时发生的一系列复杂反应，生成棕/黑色的大分子物质，同时还产生具有不同气味的中间体分子，包括还原酮、醛和杂环化合物，为食物提供诱人可口的风味和诱人的色泽。3. 还原糖的测定方法：3,5-二硝基水杨酸法在波长540nm下，一定浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，可利用标准曲线法测定样品中的还原糖含量。利用多糖能被酸水解为单糖的性质可以通过测定水解后的单糖含量来对总糖进行测定。4. Lambert-Beer定律A=lg(I0/I)=lg（1/T）=KClA：吸光度 I0：入射光强度 I：

3、透射光强度T：透光度（透射比） K：比例常数 l：溶液厚度实验仪器，试剂与材料：1. 实验仪器：UV2600紫外可见分光光度计2. 实验试剂：（1）1.0mg/ml标准葡萄糖（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS试剂）（3）6mol/L HCl（张茜配置）（4）6mol/L NaOH（张茜配置）（5）碘-碘化钾溶液3. 实验材料：市售面粉。实验步骤：1. 还原糖的提取准确称取0.20g面粉，加蒸馏水约3ml，在研钵中磨成匀浆。，转入三角烧瓶中，用约30ml蒸馏水冲洗研钵23次，洗出液也转入三角烧瓶中。于50恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出。将浸出夜（含沉淀）转移到100ml离心管中

4、，于4000r/min下离心5min，沉淀用20ml蒸馏水洗一次，再离心，将两次离心的上清液合并，用蒸馏水定容至100ml，混匀，作为还原糖待测液。取1ml进行还原糖的测定。2. 总糖的水解准确称取0.50g面粉，加蒸馏水3ml，在研钵中磨成匀浆后转入三角烧瓶中，并用12ml蒸馏水冲洗研钵23次，洗出液也转入三角烧瓶中。再向三角烧瓶中加入6mol/L HCl 10ml，搅拌均匀后在沸水浴中水解0.5h，取出12滴置于白瓷板上，加1滴I2-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不显蓝色。水解完毕，冷却至室温后用6mol/L NaOH溶液中和至pH呈中性。然后用蒸馏水定容至100ml，过滤，取

5、滤液10ml，用蒸馏水定容至100ml，成稀释1000倍的总糖水解液。取0.5ml总糖水解液，测定其还原糖的含量。3. 还原糖标准曲线的制作与样品的测定数据记录与处理：一 还原糖的提取面粉质量：m1=0.20g二 总糖的提取面粉质量：m2=0.50g6M HCl；6M NaOH（张茜配置）三 样品的测定01234567标准葡萄糖/ml00.10.20.30.40.51.0ml还原糖提取液0.5ml总糖水解液蒸馏水/ml1.00.90.80.70.60.500.5DNS试剂/ml2.02.02.02.02.02.02.02.0蒸馏水/ml4.04.04.04.04.04.04.04.0A540n

6、m00.0870.2620.4740.6630.8930.035/0.0300.297/0.263标准曲线：回归曲线为y=0.183x-0.0611) 由第六组数据分析可知,还原糖提取液对应的吸光度值为: (0.035+0.030)/2=0.032 样品还原糖含量为: X=(0.032+0.061)/0.183=0.508 实验对象中还原糖的含量为: 100X/200 = 25.4 %2) 由第七组数据分析可知,总糖提取液对应的吸光度值为: (0.297+0.263)/2=0.280 样品总糖的含量为: X=(0.280+0.061)/0.183= 1.863 实验对象中总糖的含量为: 200X/500 = 74.5 %注意事项：1. 沸水浴时应将试管口用保鲜膜封住，以防止水分蒸发引起体积误差。2. 应该待反应体系稳定后进行比色（约10min）