高效液相色谱基本理论

1、第一部分第一部分 基本理论基本理论色谱起源色谱起源 色谱分离过程色谱分离过程色谱法定义和特点色谱法定义和特点 1 1、色谱法、色谱法定义：定义：利用物质的物理化学性质建立的分离、分析利用物质的物理化学性质建立的分离、分析方法方法实质：实质：分离分离目的：目的：定性分析或定量分析定性分析或定量分析色谱法与光谱法的主要色谱法与光谱法的主要区别区别： 色谱法具有分离及分析功能，而光谱法不具备色谱法具有分离及分析功能，而光谱法不具备分离功能。分离功能。分析混合物最有力的手段分析混合物最有力的手段2 2、色谱法的特点、色谱法的特点（1 1）分离效率高）分离效率高（2 2）应用范围广）应用范围广（3 3）

2、分析速度快。）分析速度快。（4 4）样品用量少）样品用量少（5 5）灵敏度高）灵敏度高（6 6）分离和测定一次完成，可以和多种波谱分）分离和测定一次完成，可以和多种波谱分析仪器联用析仪器联用（7 7）易于自动化，可在工业流程中使用）易于自动化，可在工业流程中使用色谱法的分类色谱法的分类 气液色谱法气液色谱法 GLC GLC 气相色谱气相色谱法法 气固色谱法气固色谱法 GSCGSC 液液- -液色谱法液色谱法 LLC LLC 液相色谱法液相色谱法 液液- -固色谱法固色谱法 LSCLSC 按按两相物理状态分两相物理状态分按分离原理分按分离原理分 吸附色谱法吸附色谱法 分配色谱法分配色谱法 离子交

3、换色谱法离子交换色谱法排阻色谱法排阻色谱法（凝胶色谱法凝胶色谱法）基本类型色谱法的分离机制基本类型色谱法的分离机制1 1、吸附柱色谱法、吸附柱色谱法 第一步：吸附第一步：吸附 第二步：解吸第二步：解吸 第三步：再吸附第三步：再吸附第四步：再解吸第四步：再解吸分配系数的微小差异分配系数的微小差异吸吸附能力的微小差异附能力的微小差异 微小差异积累微小差异积累较大差较大差异异吸附能力弱的组分先吸附能力弱的组分先流出；流出； 吸附能力强的组分吸附能力强的组分后流出后流出2 2、分配柱色谱法、分配柱色谱法 3 3、离子交换色谱法、离子交换色谱法 要求：要求： 固定相固定相离子交换树脂离子交换树脂 流动相

4、流动相水为溶剂的缓冲溶液水为溶剂的缓冲溶液 被分离组分被分离组分离子型的有机物或无机物离子型的有机物或无机物分离机制分离机制固定离子可交换离子待测离子4 4、分子排阻色谱、分子排阻色谱要求：要求： 固定相固定相多孔性凝胶多孔性凝胶 流动相流动相水水凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱 流动相流动相有机溶剂有机溶剂凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱 分离机制分离机制 利用被测组分利用被测组分分子大小不同、分子大小不同、在固定相上选择在固定相上选择性渗透实现分离性渗透实现分离离子对色谱离子对色谱 离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流电荷

5、相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。法。 离子对形成机理离子对形成机理 把和被测物把和被测物离子离子A A电荷相反的电荷相反的离子离子B B（对离子（对离子或反离子）加入到流动相中，使待测或反离子）加入到流动相中，使待测离子离子A A与与反离子反离子B B形成离子对形成离子对ABAB，该，该ABAB离子对离子对的性质与的性质与A A离子离子或或B B离子离子的性质不同，即间接改变了待测的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。离子

6、的保留特性。离子对形成机理（续离子对形成机理（续）例如：固定相为非极性键合相，流动相为水例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，在流动相中加入与待测离子溶液，在流动相中加入与待测离子A A- -有相有相反电荷的离子反电荷的离子B B+ +： 由于离子对由于离子对A A- -B B+ +具有疏水性，因而被非极性具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测离子固定相提取。其它待测离子A A1 1，A A2 2，A A3 3.因因与与B B+ +间的成对能力不同，形成不同疏水性的离子间的成对能力不同，形成不同疏水性的离子对对A A1 1- -B B+ +、A A2 2- -B B+ +、 . .

7、 ，使得各待测物在柱内的，使得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的。保留值不同，从而达到分离的目的。 有机相有机相水相水相水相水相BABA键合相反相离子对色谱法键合相反相离子对色谱法 根据流动相和固定相的极性分为：反相离子对和根据流动相和固定相的极性分为：反相离子对和正相离于对色谱法。其中以正相离于对色谱法。其中以键合相离子对键合相离子对色谱法最色谱法最重要。重要。 键合相离子对键合相离子对色谱的固定相采用非极性的疏水键色谱的固定相采用非极性的疏水键合相如十八烷基键合相（合相如十八烷基键合相（ODSODS）等，流动相为）等，流动相为加有平衡离子（反离子）的极性溶液（如甲醇一水加有平衡

8、离子（反离子）的极性溶液（如甲醇一水或乙睛一水）。或乙睛一水）。 键合相反相离子对色谱法键合相反相离子对色谱法 键合相反相离子对色谱法操作简便，只要键合相反相离子对色谱法操作简便，只要改变流动相的改变流动相的pHpH值、平衡离子的浓度和种类值、平衡离子的浓度和种类，就可在较大范围内改变分离的选择性，能较好就可在较大范围内改变分离的选择性，能较好解决难分离混合物的分离问题。此法发展迅速，解决难分离混合物的分离问题。此法发展迅速，应用较广泛应用较广泛. . 色谱中基本术语色谱中基本术语 （一）色谱流出曲线（一）色谱流出曲线 （二）术语（二）术语1 1、基线、基线(base line)(base l

9、ine)：2 2、死时间、死时间 t t0 0（t tMM) )（dead timedead time）：）：3 3、死体积、死体积 V V0 0（dead volume dead volume ）：）：V V0 0 = = t t0 0F F0 04 4、保留值：、保留值：（1 1）保留时间）保留时间 t tR R （2 2）调整保留时间）调整保留时间 t tR R （3 3）保留体积）保留体积 V VR R （4 4）调整保留体积）调整保留体积 V VR R 保留值与固定保留值与固定相和流动相的性相和流动相的性质、固定相的量、质、固定相的量、柱温、流速和柱柱温、流速和柱体积有关体积有关（5

10、 5）相对保留值）相对保留值 r r2121 121221RRRRVVttr特点：特点：只与温度和两相的性质有关，而与柱径、柱只与温度和两相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速等其它色谱操作条件无长、填充情况及流动相流速等其它色谱操作条件无关，与色谱柱无关，反映了色谱柱对待测两组分关，与色谱柱无关，反映了色谱柱对待测两组分1 1和和 2 2 的选择性。的选择性。色谱法中，特色谱法中，特别是气相色谱别是气相色谱法中，广泛使法中，广泛使用的定性数据用的定性数据5 5、峰高（、峰高（h h）6 6、色谱的区域宽度、色谱的区域宽度 （1 1）标准偏差）标准偏差 （2 2）半）半( (高高)

11、 )峰宽峰宽 WW1/21/2 （3 3）峰宽或称）峰宽或称WWb b 354. 22ln222/1 WWb = 4 = 1.699 W1/21 1、分配系数、分配系数K Kmscc组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度K无因次量，由组分及两相的热力学性质决定，只随柱温、柱压而变化（三）分配系数及分配比（三）分配系数及分配比结论：结论：一定温度下，各组分在两相间的一定温度下，各组分在两相间的 K K 不同不同 ，在，在色谱柱中的移动速度不同，使得原来色谱柱中的移动速度不同，使得原来K K 仅有仅有微小差异的各组分在经过反复多次的分配后，微小差异的各组分在经过反复多次的分配后，产生很大的分离效

12、果产生很大的分离效果 K K小的组分，较早小的组分，较早 流出色谱柱流出色谱柱 K K大的组分，较晚大的组分，较晚 流出色谱柱流出色谱柱K K：色谱分离的依据：色谱分离的依据 2 2、分配比、分配比 k k ( (分配容量或容量因子分配容量或容量因子) ) msmmk 组分在流动相中的总量组分在固定相中的总量 k k值也决定于组分及两相热力学性值也决定于组分及两相热力学性质，不仅随柱温及柱压变化而变化，质，不仅随柱温及柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关而且还与流动相及固定相的体积有关 3 3、分配系数、分配系数( (K) K) 和分配比和分配比 k k 的关系的关系 令：msmm

13、ssmsVVKVcVcmmk smVV / smVVkK色谱柱的相色谱柱的相比比 K K 和和k k 与与t tR R 的关系的关系000tttttmmkRRms k k 值越大值越大t tR R越长越长 要使各组分分离，它们的要使各组分分离，它们的t tR R必须不必须不同，而同，而t tR R是由两组分的是由两组分的 K K 或或 k k 决定决定4 4、分配系数比、分配系数比（分离因子）（分离因子） 12121212RRSMSMttkkVVkVVkKK大于大于1 1是分离是分离的先决条件的先决条件 121221RRRRVVttr 相相对对保保留留值值最后从色谱图上得到以下信息：最后从色谱

14、图上得到以下信息：峰的数目，判断样品中所含组分的最少个数峰的数目，判断样品中所含组分的最少个数根据峰的保留值进行定性分析根据峰的保留值进行定性分析根据峰面积或峰高进行定量分析根据峰面积或峰高进行定量分析根据保留值和峰宽，判断色谱柱的分离效能根据保留值和峰宽，判断色谱柱的分离效能由两峰间的距离，判断评价固定相和流动相选择是否合理由两峰间的距离，判断评价固定相和流动相选择是否合理。 色谱分离的基本理论色谱分离的基本理论 色谱法是利用混合物中各组分在两相中色谱法是利用混合物中各组分在两相中的分配系数或吸附系数的不同而进行分离的。的分配系数或吸附系数的不同而进行分离的。要使各组分实现有效的分离，必须考

15、虑两方要使各组分实现有效的分离，必须考虑两方面的问题：面的问题：第一：热力学问题第一：热力学问题提出了塔板理论提出了塔板理论第二：动力学问题第二：动力学问题提出了速率理论提出了速率理论（一）塔板理论（一）塔板理论 1 1、理论假定：、理论假定：（i i）在柱内一小段长度）在柱内一小段长度H H内，组分可以内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度长称为理论塔板高度H H（ii ii）流动相进入色谱柱不是连续的，而）流动相进入色谱柱不是连续的，而是脉动式，每次进入体积为一个塔板是脉动式，每次进入体积为一个塔板体积（体积（VVmm） （iiiii

16、i）所有组分开始时存在于第）所有组分开始时存在于第0 0号塔板上，而且试样沿轴（纵）号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略向扩散可忽略 （iviv）分配系数在所有塔板上是常）分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量数，与组分在某一塔板上的量无关无关 柱效能指标柱效能指标( (n n、H H ) )理论塔板数理论塔板数N组分流过色谱柱时，在两相间进行平衡分配的总次数理论塔板高度理论塔板高度H为使组分在柱内两相间达到 一次分配平衡所需要的柱长222/1)(16)(54. 5bRRWtYtn nLH （二）速率理论（二）速率理论 塔板理论成功处塔板理论成功处： 解释了色谱流出曲线的形状和

17、浓度极大值对应解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大值对应的的t tR R 阐明了保留值与阐明了保留值与K K的关系的关系 提出了评价柱效高低的提出了评价柱效高低的n n和和H H的计算式的计算式 塔板理论存在问题塔板理论存在问题: :1 1）做出了四个与实际不相符的假设，忽略了组分）做出了四个与实际不相符的假设，忽略了组分在两相中传质和扩散的动力学过程在两相中传质和扩散的动力学过程2 2）只定性给出塔板高度的概念，却无法解释板高）只定性给出塔板高度的概念，却无法解释板高的影响因素的影响因素3 3）排除了一个重要参数）排除了一个重要参数流动相的速度，因而流动相的速度，因而无法解释柱效与流速关系，更

18、无法提出降低板高无法解释柱效与流速关系，更无法提出降低板高的途径的途径速率理论：速率理论：吸收了塔板理论的有效成果吸收了塔板理论的有效成果H H，并从动力学角度较好地解释了影响柱效的因素并从动力学角度较好地解释了影响柱效的因素CuuBAH HPLC H = He + HdH = He + Hd + Hs + Hs + Hmm + Hsm+ Hmm + Hsm 固定相传质阻力固定相传质阻力流动流动相传质阻力流动流动相传质阻力滞留流动相传质阻力滞留流动相传质阻力涡流扩散涡流扩散分子扩散分子扩散1 1、涡流扩散项、涡流扩散项HeHe HeHe A = 2dpA = 2dp2 2、分子扩散项、分子扩散项HdHd 样品在色谱柱中滞留样品在色谱柱中滞留的时间愈长，色谱谱带的时间愈长，色谱谱带的分子扩散也愈严重。的分子扩散也愈严重。 Dm10 Dm10-5 -5 cmcm2 2/s /s（比在（比在气体中要小气体中要小4 45 5个数量个数量级），所以级），所以在液相色谱在液相色谱中，纵向分子扩散项实中，纵向分子扩散项实际上可以忽略际上可以忽略 3 3、传质阻力项、传质阻力项(1)(1)固定相传质阻力项固定相传质阻力项HsHs：(2)(2)流动相传质阻力项：流动相传质阻力项：流动的流动相的传质阻力流动的流动相的