现代生物技术

1、一、 生物技术总论生物技术(biotechnology )也称生物工程(bioengineering），是人们以现代生命科学为基础，结合其他基础科学的科学原理，采用先进的工程技术手段，按照预先的设计，改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的一门新兴的、综合性的学科。(1)基因工程（重组DNA技术，gene engineering）用人工方法把不同生物的基因分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组在一起，然后把重组体放回宿主细胞内繁殖，最终获得基因产物。既用人工的手段改造生物的遗传性状，获得基因产物。(2)细胞工程（cell engineering）指以细胞为基本单位，在体外条

2、件下进行培养、繁殖或人为的使细胞某些生物学特征按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动植物个体，以获得某种有用的物质的过程。即：有目的，有计划地改造细胞，能达到细胞产物及组织本身的规模生产。细胞工程包括：动植物细胞的体外组织培养技术、细胞融合技术（也称细胞杂交技术）、细胞器移植技术、克隆技术、干细胞技术等(3)酶工程（enzyme enineering）利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能，对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。它包括酶的固定化技术、细胞的固定化技术、酶的修饰改造技术及酶反应器的设计等技术。(4)发酵工程（fer

3、mentation engineering利用生物材料（来自自然界的微生物，基因重组微生物等各种来源的动物细胞和植物细胞）生产有用物质，服务人类的一门综合科学技术。是生物工程的主要基础和支柱。给微生物一个最适合生长的条件，利用微生物的代谢功能，通过现代化工程手段生产人类所需的产品-微生物工程(5)蛋白质工程（protein engineering） 在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，从而达到对蛋白质进行修饰改造、拼接，以产生能满足人类需要的新型蛋白质 。生物芯片又称DNA芯片或基因芯片，是将高密度DNA片段阵列通

4、过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的一项新技术。现代生物技术在人类生产生活中的作用1.改善农业生产,解决食品短缺,提高农作物产量及其品质A、培育抗逆的作物优良品系,如高产、稳定、优质、抗虫、抗病、除草剂、固氮酶基因等如：抗除草剂大豆、抗黄矮病小麦、抗病毒马铃薯、耐贮运番茄。 B、植物种苗的工厂化生产c、生物农药，生产绿色食品。 D、提高粮食、饲料品质，如可饲性疫苗、富含VE的不饱和油料等功能性食品。E、生物固氮,减少化肥使用量发展畜牧业生产a.动物的大量快速无性繁殖b.培

5、育动物的优良品质2 、提高生命质量,延长人类寿命开发制造奇特而又贵重的新型药品疾病的预防和诊断基因治疗人类基因组计划(human genome project, HGP)3.解决能源危机,治理环境污染解决能源危机A、乙醇的生产 B、沼气或氢气的生产 C、提高石油的开采率环境保护A、用生物技术方法生产化工产品 B、利用微生物净化有毒的化合物、降解石油污染、清除有毒气体和恶臭物质、综合利用废水和废渣、处理有毒金属等4.制造工业原料,生产贵重金属制造工业原料氨基酸类；酸味剂；甜味剂；化工原料等生产贵重金属 利用细菌的浸矿技术，提取贫矿、尾矿、废渣里面的贵重金属谈谈你对转基因食品的看法（1) 转基因食

6、品的优点：可延长蔬菜的货架期及感官特性提高食品的品质提高食品的营养提高肉、奶和畜类产品的数量和质量增加农作物抗逆能力，增加农业产量生产可食性疫苗或药物生物功能性食品（2) 转基因食品的安全性目前有一些证据指出转基因食品具有潜在的危险但更多科学家的试验表明转基因食品是安全的任何一种转基因食品在上市之前都进行了大量的科学试验，国家和政府有相关的法律法规进行约束，而科学家们也都抱有很严谨的治学态度。一种食品会不会造成中毒主要是看它在人体内有没有受体和能不能被代谢掉，转化的基因是经过筛选的、作用明确的，所以转基因成分不会在人体内积累，也就不会有害二、细胞工程细胞全能性（totipotency）：是指分

7、化细胞保留着全部的核基因组，具有生物个体生长、发育所需要的全部遗传信息，具有发育成完整个体的潜能。植物细胞的全能性：植物组织、细胞、原生质体均具有培养成一株完整植物体的潜在能力。植物组织培养：以细胞全能性学说为理论基础，在无菌和人工控制条件下，培养、研究植物组织、器官，甚至进而从中分化、发育出整体植株的技术。外植体（explant）：能被诱发产生无性增殖系的器官或组织切段。细胞分化（cell differentiation）：指由于细胞分工而导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。细胞脱分化（cell dedifferentiation）：培养条件下使一个已分化的细胞失去已

8、分化细胞的典型特征，或消除了细胞分工，使之回复到分生细胞状态或胚性细胞状态的过程。或具有特异结构和功能的细胞转化成没有特异结构和功能的细胞的过程。细胞再分化（redifferentiatio）脱分化后无序生长的分生细胞在离体培养下，重新恢复细胞分化能力，经过细胞分化、组织分化和器官分化递进地进行，最后再生完整植株。愈伤组织：指由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的松散排列的薄壁细胞团极性（polarity）：植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。体细胞胚（胚状体、体胚）指离体条件下没有经过受精过程，由组培中体细胞（表皮细胞、薄壁组织细、叶柄或

9、侧根的韧皮部细胞）组织经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物。拟分生组织：愈伤组织在分裂期会出现导管细胞，筛管细，分泌细胞，毛状体细胞及木栓细胞等，并出现由小而密集的分裂细胞构成的细胞团。形态建成：外植体细胞在适宜的培养条件下发生脱分化、再分化，产生芽和根，或者形成胚状体，发育成苗或完整植株。原生质体(protoplast)指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露球形细胞。亚原生质体(subprotoplast)在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成的一些较小的原生质体。它可以具有细胞核，也可不具有细胞核。核质体(nuclearplast)由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形

10、成的小原生质体。也称为微小原生质体。胞质体(cytoplast)不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。条件培养基（conditioned medium）：培养过程中，有些细胞可能会分泌活性物质到培养液中，这种培养过某种细胞以后，含有细胞分泌物的培养液称为条件培养基。或：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。次生代谢：建立在初生代谢基础之上的、对于植物正常的生长发育非必需的代谢，其代谢产物即为次生代谢产物。次生代谢产物(secondary metabolites)：是由次生代谢产生的一类细胞生命活动或植物生长发育正常运行的非必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期

11、的特异性。体细胞杂交（somatic hybridization):在离体条件下通过两个亲本体细胞原生质体的融合以及随后将融合产物培养成杂种植株的过程。同核体（homokaryon）：基因型相同的细胞融合成的杂交细胞；异核体（heterokaryon）：来自不同基因型的杂交细胞多核体：含双亲不同比例核物质的融合体。亲缘关系较远的细胞间融合，融合体以一个细胞的核物质为主，加有另外一个细胞少量的遗传物质。异胞质体：含双亲中一方的染色体和双亲细胞质的融合体。人工种子：又称合成种子或体细胞种子，是指将植物离体培养的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中的类似种子的颗粒。植物无糖组培技

12、术 (Sugar-free micropropagation):又称为光自养微繁殖技术，是指在植物组织培养中改变碳源的种类，以CO2代替糖作为植物体的碳源，通过输入CO2气体作为碳源，并控制影响组培苗生长发育的环境因子，促进植株光合作用，使组培苗由兼养型转变为自养型，进而生产优质种苗的一种新的植物微繁殖技术。植物种质离体保存：是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。（一）、培养基的种类1.根据培养基态相A、固体培养基 加凝固剂(多为琼脂)外植体只是部分接触培养基，会使培养基中的效应物质产生一定

13、的浓度梯度，有利于外植体的分化、生长。（通气性较好，便于操作，但营养分布不均，生长发育不整齐。）B、液体培养基 不加凝固剂 ，外植体能够与效应物质更好地接触，生长速度比在固体培养基中更快。（营养分布均匀，生长整齐一致，但通气性差。）2.根据作用分为 诱导培养基 增殖培养基 生根培养基3.根据培养物的培养过程 A、初代培养基-第一次接种外植体的培养基。 B、继代培养基-接种初代培养之后培养物的培养基。4、根据其营养水平不同，培养基可分为 基本培养基和完全培养基。A、基本培养基（就是通常称呼的培养基） 主要有MS、White、 N6、B5 、改良MS、Heller、Nitsh、SH、 Miller

14、等。B、完全培养基就是基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物质等。植物离体无性繁殖(Propagation in vitro)：指利用植物组织培养技术，对优良植株的外植体进行离体培养，使其在短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。这种离体无性繁殖方法由于繁殖速度快，又称离体快速无性繁殖。植物快繁与传统营养繁殖相比的优点：A、繁殖效率高。生长速度快；B、培养条件可控制性强；C、占用空间小；D、管理方便，利于自动化控制；E、便于种质交换和保存。植物的离体器官发生：培养条件下的组织或细胞团分化形成不定根、不定芽等器官的过程。植物快繁的器官再生主要分为五

15、种类型：短枝发生型：指外植体携带的带叶茎段，在适宜的培养环境中萌发，形成完整植株，再将其剪成带叶茎段，继代再成苗的繁殖方法。丛生芽发生型：指外植体携带的顶芽或腋芽在适宜培养环境（含有外源细胞分裂素）中不断发生腋芽而呈丛生状芽，将单个芽转入生根培养基中，诱导生根成苗的繁殖方法。不定芽发生型：指外植体在适宜培养基和培养条件下，形成不定芽，后经生根培养，获得完整植株的繁殖方法。分为通过愈伤组织产生不定芽，和直接产生不定芽两种方式。胚状体发生型：指外植体在适宜培养环境中，经诱导产生体细胞胚，从而形成小植株的繁殖方法。原球茎发生型：是兰科植物特有的一种快繁方式。指茎尖或腋芽外植体经培养产生和种子萌发产生

16、原球茎的繁殖类型。原球茎可以增殖形成原球茎丛。与器官发生途径相比，体细胞胚的特点体细胞胚最根本的特征是具有双极性，即在发育的早期阶段从方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都是单极性的。体细胞胚的维管组织与外植体现存组织无解剖结构上的联系，而不定根或不定芽与外植体或愈伤组织的维管组织有联系。体细胞胚胎的维管组织分布是独立的Y字形结构，不定芽维管组织无此结构。合子胚胎发生：双子叶植物：合子、原胚、球形胚、心型胚、鱼雷胚和子叶胚单子叶植物：合子、原胚、球形胚、盾型胚和子叶胚体细胞胚胎发生：胚性愈伤组织诱导、体细胞胚胎诱导、体细胞胚胎早期分化发育、体细胞胚胎成熟、体细胞胚胎萌发和成苗。双子

17、叶植物：原胚、球形胚、心型胚、鱼雷胚和子叶胚单子叶植物：与双子叶诱导发生过程类似。形态上无鱼雷型胚，成熟体胚上有炖盾片、胚芽鞘和胚根等结构。细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志（即细胞分化的标志）胚状体与合子胚的比较:植物快繁的程序包括四个阶段：1、无菌（或初代）培养的建立 2、繁殖体增殖 3、芽苗生根 4、小植株的移栽驯化植物快繁的目的是以尽可能高的效率生产试管苗，获得最大的经济效益。因此，在快繁时应使各种影响因素处于最适合快繁的状态。主要影响因素： 1、外植体2、培养基3、培养条件4、继代培养5、移栽商业化生产应注意的问题1.污染污染的来源：培养基及器具、器皿污染；外植体灭菌不彻底；操作原

18、因；环境原因等污染的控制：灭菌彻底；操作正确；保持操作区环境清洁无菌。2.遗传稳定性即保持原有良种特性问题。影响遗传稳定性的因素：基因型；继代次数；器官发生方式。降低遗传变异的措施：1、选用合适的基因型；2、减少继代次数；3、采用合适的器官发生方式减少生长调节剂的使用浓度3.玻璃化：生理失调症状，表现为叶片、嫩梢呈水浸透明或半透明状。叶片脆弱易碎，角质层发育不全，没有功能性气孔。器官分化能力低，生根难，移栽后不易成活。玻璃化苗发生原因：琼脂和蔗糖浓度偏低；培养温度偏高；细胞分裂素浓度偏高；乙烯的影响；光照偏弱；培养基含量偏高等因素；通风条件不好。防止玻璃化苗发生的措施：提高培养基硬度；降低培养

19、基水势；提高蔗糖含量；增加培养瓶气体交降低湿度；增加光照，降低温度等；降低细胞分裂素含量；加入活性炭、多效唑或CCC等物质。4.褐化：定义是由于培养材料中的酚类物质被氧化形成。产生原因：植物种类和品种（如木本比草本更易褐化）；外植体年龄和取材料时间；外植体损伤程度；光温因素；培养基成分。防止措施选择合适外植体、合适的培养条件、使用抗氧化剂、连续转移。愈伤组织的分化从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时期：诱导期、分裂期、分化期。愈伤组织形态建成：不定芽方式和胚状体方式器官分化的植物激素控制理论(激素配比模式)生长素与细胞分裂素的比值是根和芽形成的控制条件，决定着发育的方向:是愈伤组织、长根

20、还是长芽。高利于根的形成生长素/细胞分裂素适中利于愈伤组织的形成低利于芽的形成原生质体的分离方法：1）、机械法：将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。2）、酶解法：指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶Driselase）、果胶酶类（果胶酶和离析酶Macerozyme）、蜗牛酶和胼胝质酶。原生质体的收集和纯化：1) 沉降法：利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过

21、滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。2) 飘浮法：采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、Percoll、Ficoll），使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法。3) 沉淀法和飘浮法结合：先沉淀后漂浮，重复操作，纯化后可用于培养或细胞融合。4) 界面法：采用两种比重不同的溶液，使原生质体处于两液相的界面之中，从而纯化原生质体的方法原生质体鉴定目的：检验获得的原生质体是否真正的原生质体鉴定方法(针对有无细胞壁)：1、低渗爆破法：原生质体在低渗溶液中吸水胀破，观察有无细胞壁碎片；2、荧光染色法：通过荧光增白剂染色后离心去除多余染料，在荧光显微镜下观察（波长3600-4400Å）

22、，绿光显示有纤维素，红光示真正的原生质体。原生质体活力检测1、染色法 FDA法：FDA（二乙酸荧光素）本身不发荧光也不具有极性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内FDA可以被酯酶裂解，将能发荧光的极性部分释放出来。荧光素则不能自由穿越质膜，在完整的活细胞内积累。伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取。2、胞质环流法：是否存在胞质环流判断原生质体活力；3、渗透压变化法：活原生质体会随外界渗透压的变化体积变化4、氧电极法：活原生质体在光照下光合放氧，无光呼吸耗氧原生质体培养方法： 1、液体浅层培养 2、固体培养 3、液体固体双层培养 4、琼脂糖珠培养原生

23、质体再生过程定义：指分离、纯化的原生质体在适当的培养方法和良好的培养条件下，很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分化出完整植株的过程。1、细胞壁再生2、细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成3、植株再生植物原生质体培养的应用1、利用原生质体融合获得融合细胞2、利用原生质体进行外源基因的转化3、利用原生质体再生植株4、利用固定化原生质体培养生产次级代谢产物 较多的分泌产物5、利用原生质体进行生物转化通过原生质体中存在的酶或酶系的催化作用，将酶作用的底物转化为所需的产物，提高转化效率单细胞的分离机械法：将叶片轻轻研碎，经过滤和离心，收集和净化细胞。酶法：利用果胶酶、纤

24、维素酶处理植物叶片或其他外植体，使细胞分离。化学法：利用一些化学药剂游离细胞，如草酸钙，秋水仙素等。单细胞的培养方法平板培养：将一定量细胞接种到或混合到装有一薄层固体培养基的培养皿内进行培养的方法。看护培养：是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法；液体浅层培养：先将细胞制成一定密度的细胞悬浮液，用吸管将悬浮液移到培养皿中形成浅层，一般1mm左右，石蜡膜封口，静置培养。微室培养（微滴培养）：在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团。细胞悬浮培养：将植物游离细胞或细小的细胞团在液体培养基中培养。悬浮培养的基本形式分批培

25、养(batch culture)：一个容器的细胞培养结束后，细胞被分散到新的容器中继续培养。连续培养(continuous culture)：在一个容器（或者系统）中连续不断的培养植物细胞。意义：植物细胞代谢调节的研究某种生长限制因子对细胞生长的影响次生物质的大量生产细胞生长曲线 在整个培养过程中，细胞数目不断发生变化，呈现出明显的由慢到快，再到慢，最后增长停止的细胞周期。 细胞的生长呈S形曲线1、滞后期 (lag phase) 2、指数生长期(exponential phase 3、直线生长期(linear phase) 4、减慢期(progressive deceleration phas

26、e 5、静止期(stationary phase)悬浮培养细胞的同步化同步培养：指培养体系中大多数细胞的细胞生长周期是一致的，即体系中大多数细胞都能同时通过每一个细胞生长周期阶段。（1）物理方法A 按细胞团的大小通过对细胞物理特性（细胞或小细胞团的大小）的控制，以实现高度的同步化B 低温休克法通过对生长环境条件（光照、温度等）的控制，以实现高度的同步化（2）化学方法A 饥饿法使悬浮培养体系缺少一种细胞生长必须物质，而使细胞稳定地处于某一生长期，当重新向培养基中转入到一新鲜营养完全的培养基时，细胞又恢复生长并实现细胞生长的同步化。B 抑制法使用DNA合成抑制剂，如5-氨基尿嘧啶、羟基尿和胸腺嘧啶

27、脱氧核苷，可阻止细胞周期进程而使细胞集中在某一特定的生长周期。C 秋水仙素法秋水仙素是最有效的纺锤体形成抑制剂之一，可把细胞集中于细胞分裂期的中期。获得次生代谢物的方法1、 从植物中提取：可靠，但受到资源的限制，会破坏野生资源；人工栽培则占用土地、受病虫害、自然灾害等因素的限制。2. 化学合成：产量高、成本低，但污染环境，而且有些物质结构复杂，难以人工合成，如海南粗榧内酯；有些虽然可以人工合成，但成本太高，如紫杉醇等。3. 植物细胞大规模培养：植物细胞不仅具有形态全能性，而且也有化学全能性（在离体条件下可以合成整株植物能合成的物质）。体细胞杂交步骤：1、原生质体的制备2 、原生质体的融合3、杂

28、种细胞选4 、杂种细胞培养5 、由愈伤组织再生植株6 、杂种植株的鉴定原生质体融合1、自发融合同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并；2、诱发融合异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。物理法：显微操作，电场刺激等化学法：硝酸钠诱导、PEG结合高pH，高钙离子法生物法：仙台病毒法杂种细胞的选择系统：外观选择 遗传互补筛选法 抗性互补筛选 生长特性筛选法 物理特性筛选法 其它方法：如采用显微操作技术也能把单个异核体分离出来进行培养。体细胞杂种在农业生产上的应用1 对无性繁殖植物或性不育植物进行遗传重组对2个不能进行有性繁殖的物种之间实现遗传重组，体细胞融合目前看来是唯一途径。性不育植物（单倍体

29、、三倍体和非整倍体），融合后产生可育的二倍体或多倍体。2 克服有性不亲和性障碍由于存在不亲和障碍，种间或属间有性杂交虽能进行，但难以产生杂种，而通过体细胞融合，有可能突破有性杂交的这种局限性。3 细胞质遗传性状的转移细胞质雄性不育（cms）性状的转移转移由细胞质基因控制的重要农艺性状，如光和速率、对高温和低温的耐性，以及抗病性和抗除草剂特性等。1、花药是花的雄性器官，花药培养属器官培养；2、花粉是单倍体细胞，花粉培养属于细胞培养。3、花药和花粉都可以在培养过程中诱导单倍体细胞系和单倍体植株。4、单倍体植株经过染色体加倍就成为纯合二倍体植株，这样可缩短育种周期，获得纯系。花培已成为植物育种的一种

30、重要手段。 花粉和花药培养的研究意义· 诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期· 有利于筛选隐性突变体，提高选择效率· 获得无病毒个体· 有利于隐性基因控制性状的选择· 快速获得自交系的超雄株花药培养一般选择花粉的单核期进行接种。单倍体植物天然发生的途径：1、 孤雌生殖 也称单性生殖，即卵不经过受精也能发育成正常的新个体，如黄瓜。2、 无配子生殖 是指配子体可以配子的结合而直接产生孢子体的，如蕨类植物3、 孤雄生殖 是指由雄性配子直接进行胚胎发育成新个体。通常由杂交或实验处理后获得的，自然界中很少发生单倍体植株染色体加倍的方法·

31、1、自然加倍· 2、人工加倍：用秋水仙素溶液浸苗、处理愈伤组织和用含0.4%秋水仙素的羊毛脂涂抹单倍体植株的顶芽、腋芽，可得到能结实的二倍体植株。· 3、愈伤组织反复继代培养，可得到二倍体植株脱毒方法1、 茎尖培养脱毒 2、热处理脱毒 3、热处理结合茎尖培养脱毒 4、愈伤组织培养脱毒5、珠心胚培养脱毒 6、微尖嫁接脱毒植物种质离体保存：常用的离体保存方法有缓慢生长保存(slow growth conservation)和超低温保存(cryopreservation)。前者适合中短期保存，后者用于长期保存。缓慢生长保存1降低培养温度2 培养基中添加生长延缓剂或生长抑制剂来抑制

32、保存材料的生长，延长其继代周期。3 提高培养基渗透压4适宜的光照强度5合适的包扎物6培养基的营养控制，降低培养基中的养分水平7 降低培养环境中的氧气浓度超低温冷冻保存为什么没有把细胞冻死？细胞冰冻结冰保护性脱水理论溶液的玻璃化理论人工种子的组成、功能   1 体细胞胚n 为了使人工种子在一定条件下萌发生长，并形成完整植株，人工种子首先应该具备一个能够很好地发育成完整植株能力的胚，它具有胚根和胚芽的双极性，经原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶形胚等不同阶段发育而成。 2、人工胚乳n 人工胚乳为体细胞胚萌发提供营养物质。根据使用者的目的，可向人工胚乳内自由添加有利于胚状体正常萌发所需的各

33、种营养成分、防病虫物质、植物激素等，也是人工种子优越于天然种子之处。3、人工种皮包裹在人工种子的最外层，对人工种子起到保护作用，保护人工种子内部的水分和营养不致丧失和防止外部物理冲击，还要保证通气。三、基因工程基因是生物遗传信息的载体，它是由核苷酸序列(通常为DNA)组成的生物大分子，决定着生物的所有性状、行为和疾病的发生。基因在结构上并不是不可分割的最小单位，一个基因还可以划分为若干个小单位：突变单位（突变子 muton）：发生突变的最小单位。最小的突变子是一个核苷酸对。 重组单位（重组子 recon）：可交换的最小单位。最小的重组单位也可以只是一个核苷酸对。功能单位（顺反子cis

34、tron，又叫作用子）：顺反子是一个遗传功能单位，一个顺反子决定一条多肽链基因组:一个生物体的全部DNA序列。半保留复制1957年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则” (central dogma)，揭示了遗传信息的流向和表达问题。基因工程研究的理论依据（特点）1)不同基因具有相同的物质基础。(2)基因是可切割的(3)基因是可以转移的(4)多肽与基因之间存在对应关系(5)遗传密码是通用的(6)基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代基因工程一般操作步骤（1）分离带有目的基因DNA片段；（2）通过体外重组将基因插入载体；（3）将重组DNA分子转移到适当的受体细胞并与之一起增殖；（4）扩增克

35、隆的基因；（5）筛选重组体克隆。 （6）对克隆的基因进行鉴定或测序；（7）控制外源基因的表达（8）得到基因产物或转基因动物、植物。基因工程四大要素： 供体基因 载体工具 受体细胞（细菌、植物和动物）l DNA的变性：在物理或化学因素的作用下，DNA互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋的两条互补链松散而分开成为单链，从而导致DNA的理化性质及生物学性质发生改变。l DNA的变性温度：加热DNA溶液，使其对260nm紫外光的吸收度突然增加，达到其最大值一半时的温度，就是DNA的变性温度（融解温度，Tm）。Tm的高低与DNA分子中G+C的含量有关，G+C的含量越高，则Tm越高。l 核酸分子杂交：

36、两条来源不同的单链核酸（DNA或RNA），只要它们有大致相同的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形成新的杂种双螺旋。l 核酸杂交可以是DNA-DNA，也可以是DNA-RNA杂交。探针技术 将一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料对它的末端或全链进行进行标记，称为“探针”然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。印渍技术的类别及应用1. DNA印渍技术： 又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析，检测DNA。 。2. RNA印渍技术： 又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析，检测RNA。3. 蛋白质印渍技术： 又称

37、为Western杂交，或免疫印渍技术，即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。 Ø 核糖核酸酶(ribonuclease, RNase)Ø 降解RNA分子成核苷酸。用于清除DNA制备物中 的污染的RNA分子，如Rnase A,B; Rnase H等。Ø 脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease,DNase)Ø 降解DNA分子成核苷酸。Ø 核酸外切酶(exonuclease)从分子链的末端顺次水解磷酸二酯键而生成单核苷酸作用的酶Ø 核酸内切酶(endonuclease)Ø 非限制性核酸内切酶:在

38、DNA分子内部、不识别特定的序列、任意位置、随即切割。Ø 限制性核酸内切酶（限制酶)(Restriction Endonuclease)可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，2. 限制性内切酶的命名 1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。 大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。 2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如EcoK, EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。 3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限

39、制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoR I，EcoR V。 4. 限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上M（Modification）(现已省略)。限制性核酸内切酶切割双链DNA，产生2种不同的切口： 粘性末端平末端(blunt terminus)同裂酶：来源不同，但具有相同的识别序列。同裂酶进行同样的切割，产生不同或相同的末端。同尾酶：识别位点不同，但切割后产生相同末端。l PCR (polymerase chain reaction)即聚合酶链式反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-复性-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操

40、作技术。PCR基本原理： PCR是在试管中进行DNA复制反应，基本原理与体内相似，在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶等存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。l PCR反应的基本步骤：1变性(denaturing)：通常采用加热变性，即将模板DNA或延伸后的双链DNA加热到94-950C，使双螺旋DNA解开成为单链。 2复性(退火，annealing)：通过降低反应温度至550C（通常37-550C），使两种引物能与两条解开的DNA互补链的3端粘合，以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3-OH。3延伸(extension)：将反应温度提高到70-720C，在

41、耐热DNA聚合酶的催化下，根据模板DNA提供的碱基顺序，合成两条互补链，从而使模板DNA扩增一倍。DNA连接酶的种类 （一）T4噬菌体DNA连接酶 ：1) 粘性末端的连接 2) 平头末端的相连 （二）E.coli DNA连接酶 ：只能催化双链DNA片段互补粘性末端之间的连接。互补黏性末端片段之间的连接： E.coli DNA连接酶、 T4 DNA连接酶平末端片段之间的连接： T4 DNA连接酶DNA片段末端修饰后连接：用外切核酸酶VII将粘性末端修饰成平末端用末端脱氧核苷酸转移酶将平末端修饰成粘性末端DNA片段加连杆或衔接头后连接（补充知识）基因的结构1、 原核细胞的基因结构2、真核细胞的基因

42、结构a 真核生物基因表达调控过程更复杂； b 基因及基因组的结构特点不同，如真核生物基因具有内含子结构等； c 转录与翻译的间断性，原核生物转录与翻译同时进行，而真核生物该两过程发生在不同区域，具有间断性； d 转录后加工过程； e 正负调控机制； f RNA聚合酶种类多载体：是由在细胞中能够自主复制的DNA分子构成的一种遗传成分；基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体。二）载体应具备的特征条件1.能在宿主细胞内独立和稳定的自我复制2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具

43、有多种单一的酶切位点5.具有合适的选择性标记 克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可；表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子；穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。能在两种不同的生物中复制的。基因克隆载体基因克隆载体：能够承载外源基因，并将其带人受体细胞得以稳定维持的 DNA 分子称为基因克隆载体(gene cloning vector)。 l 应具备的条件： 含有克隆位点，并且

44、尽可能的多。 能携带外源 DNA 片段(基因)进入受体细胞并随其同步复制。 含有标记基因。 克隆载体必须是安全的。质粒:是存在于天然细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌的抗药基因。三种构型 :cccDNA （共价闭合环形DNA ）ocDNA（开环DNA）LDNA同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同： SC DNA最快、L DNA次之、OC DNA最慢。 根据拷贝数多少，将质粒划分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid）只在细胞 周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制(拷贝数少，为1-5个)松弛型复制控制的

45、质粒（relaxed）在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝， (可达10-200个拷贝) 当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌的死亡时，就需要低拷贝的载体。所有的质粒载体都有三个共同的特征：复制子、克隆位点和选择性标记复制子是含有DNA复制起始位点的一段DNA（ori），也包括表达由质粒编码的复制必需的RNA和蛋白质的基因。克隆位点是限制性内切酶切割位点，外源性DNA可由此插入质粒内，而且并不影响质粒的复制能力，或为宿主提供选择性表型。选择性标记对于质粒在细胞内持续存在时必不可少的。选择性标志：编码抗生素抗性的基因对质粒载体来说是最普遍的

46、细菌选择性标志（如pBR322）；主要的抗生素选择基因有：氨苄青霉素，氯霉素，四环素和卡那霉素四种。插入失活当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活标记基因的种类 1. 抗性标记基因（可直接用于选择转化子） a.  抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cdr c. 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因 2. 营养标记基因（可直接用于选择转化子）主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1

47、，URA3，LEU2，HIS4等。 3. 生化标记基因其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ， GUS，CAT 4. 噬菌斑三、构建质粒克隆载体的基本策略（Slightly more exotic plasmid vectors）1 能在转化的受体中进行有效复制、有较多拷贝数（松弛型的质粒ori）。2 克隆位点：尽可能多一些，至少有一个。可用 MCS连杆，MCS是指含多种内切酶识别序列的多克隆位点（multiple cloning site），又称多聚接头（polylinker）。3 筛选标记基因：选择标记区内有合适的克隆位点，当外源DNA插入时，标记gene将失活而成为筛选的标识。

48、4 构建的质粒克隆载体应尽可能小。大于15kb的plasmid转化效率明显。5 根据需要，使构建的质粒克隆载体组装各种“元件”（小DNA片段）。如插入启动子，终止子。病毒克隆载体噬菌体是吃细菌的病毒颗粒（viruses, “eater of bacteria”）。病毒由DNA（or RNA）、外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。进入宿主细胞后，利用宿主细胞的合成系统进行DNA（or RNA）复制和壳蛋白的合成。DNA和RNA不能共存于同一种病毒中。噬菌体有严格的宿主专一性，限制了其作为载体使用的范围。温和噬菌体（Temperate phages ）：插入宿主染色体DNA随着宿主细胞的复制而复制

49、溶原阶段（Lysogenic Cycle）烈性噬菌体（Virulent phages）：不插入宿主染色体DNA自主复制溶菌阶段（Lytic Cycle）真核细胞应用的载体 1 Ti 质粒（ Ti：Tumor-induce肿瘤诱发）根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)与Ti质粒的G-菌，可侵入90科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤(crown gall tumor)。目的基因：在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。内含子是阻断基因线性表达的序列。DNA上的内含子会被转录到前体RNA中，但RNA上的内含子会在RNA离开细胞核进行

50、转译前被剪除。外显子：在成熟mRNA被保留下来的基因部分被称为外显子。基因文库：一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段克隆在载体DNA分子中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体，将包含了这个生物体的整个基因组，也就是构成了这个生物体的基因文库。 基因组DNA文库:将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为基因组DNA文库。含有外显子和内含子。cDNA文库：某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，并将其引入到相应的宿主细胞中繁殖和扩增，理论上此群体就包含

51、有该物种的全部mRNA信息。受时空限制，不含内含子。基因组文库和部分基因文库的比较2.基因文库的构建方法直接分离法多用于原核生物（真核生物）人工合成法、（1） 鸟枪法（2） 反转录法（3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 反转录法以目的基因转录成的信使RNA为模板，再反转录酶的催化下反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，即cDNA，从而获得所需的基因。获取目的基因的方法1、用限制性内切核酸酶酶切法直接分离目的基因 2、从基因文库中获取 3、利用PCR技术扩增 4、利用化学方法人工合成1 受体细胞受体细胞选择依据： 便于重组 DNA 分子的导入和筛选克隆子； 重组

52、DNA 分子在受体细胞内能稳定维持； 适于外源基因的高效表达，表达产物的分泌或积累；具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达； 遗传性稳定，对遗传密码的应用上无明显偏倚性； 易于扩大培养或发酵；在理论研究或生产实践上有较高的应用价值。 安全性高，不会对外界环境造成生物污染；受体细胞种类l 原核生物细胞 大多无细胞壁，易于外源DNA的导入 无核膜，染色体DNA无固定结合蛋白，易于DNA重组。 基因组小，易于分析外源基因。 多单细胞生物，培养简单，繁殖迅速，重复快。l 真核生物细胞 酵母 植物细胞 动物细胞2 重组DNA导入受体细胞（一）转化： 外源DNA转化法目的基因进入_受体细胞_

53、内，并且在 受体细胞内维持_稳定_和_表达_的过程转导是指通过噬菌体将一个宿主的DNA转移到另一个宿主的细胞中而引起的基因重组现象 转染（transfection）采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，即宿主菌先经过CaCl2，电穿孔等处理成感受态细菌，再将重组噬菌体DNA直接导入受体细胞，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖，这种方式称为转染。转染是转化的一种特殊形式。重组DNA导入受体细胞外源DNA转化法(1)化合物诱导转化法(2)Ti质粒载体转化法 (3)电穿孔转化法(4)微弹轰击转化法 (5)激光微束穿孔转化法 (6)超声波处理转化法(7)脂质体介导转化法(8)体内注射转化

54、法(9)花粉管通道转化法(10)精子介导法 (11)低能离子束介导转化法感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cells) 。重组 DNA ：将目的基因（外源 DNA 分子）用 DNA 连接酶在体外连接到适当的载体上，即 DNA 分子的体外重组，这种重新组合的 DNA 称为重组 DNA 重组子：含有重组DNA分子的转化细胞。转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞，受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，把它组合到自己的基因组中，从而获得供体菌部分遗传

55、性状的现象。重组子的筛选和鉴定一、载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 2. b-半乳糖苷酶显色反应选择法二、根据插入基因的表型选择利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。 1.弥补缺陷：转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷 2. 增加新性状：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等三、DNA电泳检测法：直接电泳、酶切电泳、PCR扩增四、核酸杂交检测：Southern杂交、Northern杂交五、免疫化学检测：Western杂交、酶联免疫吸附测定。四 五 六 发酵 酶 蛋白 工程微生物工程：它是一门将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机地结合起来，利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。由于它以培养微生物为主，所以又称微生物工程。 发酵工程：指在最适发酵条件下,在发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的技术。  发酵工程包括代谢工程和发酵工艺两个主要内容。 微生物转化是利用微