高去酰胺碱性蛋白酶产酶条件及酶学性质的研究.doc

1、黑龙江东方学院黑龙江东方学院本本 科科 生生 毕毕 业业 论论 文（设文（设 计）计）高去酰胺碱性蛋白酶产酶条件及酶学性质的研究姓 名 王玉玲 学 号 054131134 专 业 食品科学与工程 班 级 2005-B 指导教师 那治国 学 部 食品与环境工程学部 答辩日期 2009 年 5 月 23 日 黑黑龙龙江江东东方方学学院院本本科科生生毕毕业业论论文文（设设计计）评评语语（一一）姓名学号专业班级总成绩毕业论文（设计）题目：答辩成绩答辩委员会评语主任签字： 年 月 日答辩委员会成员签字学部毕业论文（设计）领导小组意见组长签字： 年 月 日 学部公章黑黑龙龙江江东东方方学学院院本本科科生生

2、毕毕业业论论文文（设设计计）评评语语（二二）姓名学号专业班级毕业论文（设计）题目：指导教师成绩指导教师评语指导教师签字： 年 月 日黑黑龙龙江江东东方方学学院院本本科科生生毕毕业业论论文文（设设计计）评评语语（三三）姓名学号专业班级毕业论文（设计）题目：评阅教师成绩评阅教师评语评阅教师签字： 年 月 日黑黑龙龙江江东东方方学学院院本本科科生生毕毕业业论论文文（设设计计）任任务务书书姓名学号专业班级毕业论文（设计）题目：毕业论文（设计）的立题依据主要内容及要求进度安排学生签字：指导教师签字：年 月 日本表一式三份，学生本人、指导教师、学部各一份。黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计）I高去酰胺碱性

3、蛋白酶产酶条件及酶学性质的研究摘 要微生物碱性蛋白酶具有多样性的特点，即使是同一类型的酶，由于来源不同，性质也各不相同。本文以去酰胺度和肽键水解度为指标，对地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）2709 的突变株 SDL-9 的产酶条件及酶学性质进行了研究。首先对B.licheniformis SDL-9 的最佳产酶条件进行研究，结果表明：接种量 2%，最佳碳源为2%玉米粉、最佳氮源为 2%大豆蛋白，在培养基中添加 0.9%的谷氨酰胺对产高去酰胺碱性蛋白酶具有明显的诱导作用，起始 pH7.0，发酵温度 35，装液量35mL/100mL，摇床转速 200r/min。最后以去酰胺度为指标，

4、对菌株 SDL-9 所产的高去酰胺活性碱性蛋白酶的酶学性质进行了初步研究，结果表明：40为最适作用温度，最适作用 pH 为 9，该酶热稳定性一般， 60保温 2h 后仅存 5.4%的去酰胺能力；pH稳定性较好，在 pH710 之间均保持 90%以上的去酰胺能力；金属离子对该酶的去酰胺能力影响较大，Tween-80 对该酶的去酰胺能力具有明显的促进作用。关键词：碱性蛋白酶；地衣芽孢杆菌；去酰胺黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计）IIStudy on the Enzyme Production ConditionsAlkaline Protease with High Deamidation an

5、d the Enzymatic PropertiesAbstractMicrobial alkaline protease has the multiple characteristics，Even if is the identical type enzyme，Come from different sources，The nature is also various. In this paper, Peptide bond hydrolysis degree (DH%) and the degree to amide (DAD%) for the judgement based on tw

6、o indicators, by enzyme production conditions and enzymatic properties for target, Of Bacillus licheniformis (B.licheniformis) 2709 mutant of the SDL-9 enzyme production conditions and properties were studied. First best produces the enzyme condition to B.licheniformis to conduct the research, the r

7、esults showed that: the best carbon source for was 2% of the corn meal, The best nitrogen source was 2% of soy protein, and Add in the medium of glutamine 0.9% to produce high to amide alkali protease has obvious entrainment，starting pH 7.0，fermentation temperature 35, liquid volume 35mL/100mL, rota

8、tion speed 200r/min. Finally, enzymatic properties of the alkaline protease with high deamidation from SDL-9 strains were preliminarily studied, by using deamidation capacity as the indicators. the results showed that: 40 was the optimal temperature, and the enzyme to have a higher deamidation capac

9、ity between 35 to 45; the optimal pH 9, the enzyme had a higher deamidation capacity under alkaline conditions (pH8 11); thermal stability of the enzyme was in general, its activity fell to 52.3% under the condition of 50 for 2h, and it activity only had 5.4 percent under the condition of 60 for 2h;

10、 PH stability was better, it activity could keep up 90%, in the pH710; Metal ions had a larger influence on the enzymes ability to deamidation, Tween-80 had a clear-promoting effect on the enzymes deamidation ability. Keywords：Alkalinity protease; modification; soybean peptide目 录摘 要.I IAbstract.IIII

11、第 1 章 绪 论.1 11.1 大豆蛋白概述 .11.2 大豆蛋白的功能性质和去酰胺改性研究 .11.2.1 大豆蛋白的功能性质 .21.2.2 大豆蛋白的改性研究 .21.2.3 大豆蛋白的去酰胺改性 .31.3 碱性蛋白酶的研究现状 .41.3.1 碱性蛋白酶的性质 .41.3.2 碱性蛋白酶的酶学性质 .51.3.3 碱性蛋白酶国内外的研究现状及应用 .51.4 本文的目的意义及主要研究内容 .61.4.1 本文的目的意义 .61.4.2 主要研究内容 .6第 2 章 材料与方法.8 82.1 试验材料与仪器 .82.1.1 菌株 .82.1.2 培养基 .82.1.3 主要试剂 .8

12、2.1.4 主要仪器设备 .82.2 试验方法 .82.2.1 粗酶液的制备 .92.2.2 测定方法 .92.2.3 高去酰胺碱性蛋白酶产酶条件的优化 .112.2.4 高去酰胺碱性蛋白酶酶学性质的研究 .12第 3 章 结果与分析.14143.1 高去酰胺碱性蛋白酶产酶条件的优化 .143.1.1 SDL-9 种子生长曲线.143.1.2 接种量对产酶的影响 .143.1.3 碳源对产酶的影响 .153.1.4 氮源对产酶的影响 .153.1.5 诱导物谷氨酰胺对产酶的影响 .163.1.6 起始 pH 值对产酶的影响 .163.1.7 发酵温度对产酶的影响 .173.1.8 不同装液量对

13、产酶的影响 .173.1.9 摇床转速对产酶的影响 .183.2 高去酰胺碱性蛋白酶酶学性质的研究 .183.2.1 酶的最适作用温度 .183.2.2 酶的最适作用 pH 值 .183.2.3 酶的热稳定性 .193.2.4 酶的 pH 稳定性 .193.2.5 金属离子对该酶去酰胺能力的影响 .203.2.6 表面活性剂浓度对该酶去酰胺能力的影响 .20结 论.2222参考文献.2323致 谢.2424黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计）1第 1 章 绪 论1.1 大豆蛋白概述我国是大豆的故乡，品种资源极为丰富，产量极大，尤其北方种植甚为广泛，大豆的加工历史十分悠久，早在 2000 多年前

14、，在中华民族的繁衍与发展过程中，大豆制品具有不可磨灭的贡献。大豆的蛋白质含量非常丰富（一般在 35%45%） ，且具有及高的营养性，不但含有 8 种人体必需的氨基酸，而且氨基酸比例比较合理，它与牛奶蛋白、鸡蛋蛋白和牛肉蛋白有同等营养价值，是一种全价蛋白。大豆蛋白不仅营养价值高，而且还有多种保健作用，可以防治多种疾病，并可预防肥胖。在食品加工业中大豆蛋白所具有的更为重要的特征是它具有与食品的嗜好性、加工性等相关的各种功能特性。然而，大豆蛋白在现代食品加工中的应用受到了一定的限制。这是因为：首先，大豆蛋白的功能性质还不能满足现代食品加工的需求，不同的食品对功能性质的要求不同，某些功能性需要加强或减

15、弱；其次，大豆蛋白的功能特性是与其结构密切相关的，要获得具有良好功能的大豆蛋白制品，就必须要求原料大豆蛋白有高的溶解性、分散性1，而大豆蛋白中的 11S 球蛋白（占大豆蛋白总含量的 31%以上）的溶解性较差。为此，加强或改善大豆蛋白的功能特性，特别是提高大豆蛋白的溶解性已成为食品加工业亟待解决的问题。目前，常用提高大豆蛋白溶解性的方法主要是蛋白酶酶解，这种方法虽然能在很大程度上提高溶解性及改善某些功能性，但大豆蛋白原有的保健功能受到了不同程度破坏。而利用去酰胺方法对大豆蛋白进行改性，不仅可以提高蛋白质的溶解性、凝胶性等功能性，而且能很好的保留其保健功能2。因此，通过去酰胺改性方法制备高活性大豆

16、蛋白是非常必要的。去酰胺改性方法包括物理方法、化学方法和生物酶法。物理改性虽然具有安全性好、作用时间短及对营养性质影响较小等优点，但改性效果并不十分明显，而化学改性出于安全性的考虑，多用作基础理论研究的分析手段3。而酶法去酰胺改性属酶工程在食品加工业中应用的新技术，具有高效、安全的特点。尽管动物酶、植物酶提取生产复杂，价格昂贵，而目前看好的微生物酶以其原料来源广泛、价格低廉、效果显著、安全性高等优点，将会在未来取得主导地位。因此，应用微生物蛋白酶对大豆蛋黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计）2白进行去酰胺改性，将成为蛋白改性领域的发展趋势，拥有广阔的应用前景。1.2 大豆蛋白的功能性质和去酰胺改

17、性研究1.2.1 大豆蛋白的功能性质大豆蛋白不仅具有丰富的营养价值和保健功能，而且具有与食品的嗜好性、加工性等相关的各种功能特性，所以广泛应用于食品加工业及其他行业中。大豆蛋白质的功能特性是指对人们所期望食品特征产生影响的一些物理和化学性质，它对于食品或食品成分在贮藏、加工或销售中的物理性质起着重要作用。蛋白质的功能性质主要分三类：(1)水合性，包括水吸收及保留、溶胀、分散性、溶解度和粘度。由蛋白质肽链骨架上的极性基团与水分子发生水化作用；(2)与蛋白质蛋白质相互作用有关的性质，包括沉淀作用、凝胶作用、蛋白质面团及纤维结构的形成。蛋白质分子受热舒展，内部的疏水基团暴露出来，通过疏水作用、静电作

18、用、氢键或二硫键交联形成空间网状结构；(3)表面活性，包括表面张力、乳化作用和起泡沫作用4。食品体系的大豆蛋白所具有的典型功能特性，如表 1-1 所示。表 1-1 食品中大豆蛋白功能特性功能性质作用方式应用的食品体系溶解性依赖于 pH 的蛋白溶解性饮料、蛋黄酱吸水性亲水性肉类、肠、面包、蛋糕凝胶性蛋白质的网络形成基质肉、乳酪、豆腐弹 性形成凝胶时的二硫键连接肉、烤制品乳化性脂肪乳化体系的形成和稳定肉、蛋糕、腊肠、汤吸脂肪游离脂肪酸的束缚肉、腊肠、油炸食品起泡性形成泡膜搅打食品、薄饼干、蛋糕黏着性蛋白质作为粘性物质肉、汤、烤制品粘 性增稠、束水汤、肉汁1.2.2 大豆蛋白的改性研究大豆蛋白改性就

19、是通过改变蛋白质的分子结构，进而改变其一个或几个理化性质，达到加强或改善蛋白质功能性的目的。常用的改性方法有物理改性、化学改性、酶改性和生物工程改性。物理改性是指通过加热、冷冻、加压、磁场、电场等物理手段来改善蛋白质的功能特性的方法。物理改性具有安全性好、作用时间短以及对产品营养性能影响小等优黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计）3点，但也同时存在设备投入大，改性范围窄等缺点5。化学改性方法主要是指采用化学方法针对蛋白中的氨基、羟基、羧基和巯基进行改性，具有反应简单、效果显著的特点，但同时也存在反应条件苛刻，易有化学物质残留和副产物混杂等缺点，蛋白质的化学改性方法主要有酸碱处理、磷酸化、糖基化、

20、酰化、去酰胺、共价交联以及氧化方法，其中去酰胺改性是近年来倍受关注的蛋白改性方法。生物工程改性是指应用植物育种和分子技术，改变蛋白质分子的结构，进而影响其功能性质的方法。大豆蛋白的酶法改性就是通过酶部分降解蛋白质，并对蛋白质分子的氨基酸残基侧链基团进行修饰，从而改变蛋白质的功能性质。酶法改性具有专一性强、条件温和，无毒副作用的特点，受到人们的广泛关注。随着一些新用途的酶的发现和应用，极大的拓宽了酶法改性的应用范围，目前，许多化学改性方法都可用酶法代替，如去酸胺、磷酸化、交联聚合、氧化等。所涉及的酶包括有各种类的蛋白酶、转谷氨酰胺酶(TGase)、磷酸酶以及过氧化氢酶等6。1.2.3 大豆蛋白的

21、去酰胺改性去酰胺改性是近年来在蛋白改性研究中备受关注的研究课题之一。由于油料蛋白中含有丰富的天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)残基，所以蛋白肽链上的酰胺残基对蛋白质的高级结构形成的贡献率较高，对蛋白质的溶解性等功能性质有重要影响。所以去酰胺改性可以使蛋白质的功能性质尤其是溶解性得到很大提高7，而溶解性往往影响蛋白质其它功能性质如增稠、起泡、乳化和凝胶作用等。 去酰胺改性方法包括物理方法、化学方法和生物酶法8。物理方法包括高温热去酰胺和控制温度、湿度和 pH 值的双螺杆挤压法去酰胺，这两种物理去酰胺方法采用110以上的高温处理，去酰胺度最高达 29.65% 。化学方法去酰胺有酸法、碱法和磷酸

22、盐等其它阴离子法对蛋白质去酰胺改性。用碱催化去酰胺改性仅台湾有报道，这种方法虽然速度快，但使得蛋白质中的氨基酸发生了消旋作用，使必需氨基酸的 L-对映体减少和消化率降低，并产生赖氨酸、丙氨酸，毒理研究表明它对小鼠肾有毒害作用，因此研究甚少。酸法去酰胺是一种常用而且有效的去酰胺方法，很多学者用稀盐酸或稀醋酸对谷朊粉、麦胶蛋白和花生蛋白进行处理，得到很好的去酰胺效果9。生物酶法去酰胺是用特定的酶在一定条件下对蛋白质进行去酰胺改性。酶法去酰胺中，转谷黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计）4氨酰胺酶(TGase)在无伯胺存在的情况下，可催化蛋白质的谷氨酸残基释放出侧链基团中的氨。肽谷酰胺酶(PGase)

23、用于热变性大豆蛋白的去酰胺需先用蛋白酶水解蛋白质至一定程度或湿热法(100，15min)进行预处理，再用 PGase 作用，脱氨速率可增加 27倍10。蛋白酶中的木瓜蛋白酶(Papain)、链霉蛋白酶(Pronase)、胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)、微生物碱性蛋白酶对大豆蛋白和谷朊粉都具有一定的去酰胺能力，且水解度在 0%10%之间。1.3 碱性蛋白酶的研究现状1.3.1 碱性蛋白酶的性质碱性蛋白酶是指在 PH 值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类。碱性蛋白酶除可催化蛋白质水解为氨基酸外，在有机溶剂中还可催化多肽的合成。1.3.1.1 碱性蛋白酶的一般性质微生物碱性蛋白酶的作用 p

24、H 值一般在 711 范围内有活性。在以酪蛋白为底物时的最适 pH 多在 9.510.5 范围内，这些酶除可以水解肽键外，还具有水解酯键、酰胺键和转酯及转肽的能力。多数微生物碱性蛋白酶不耐热，在 5060加热 1015min,几乎一半酶的活性下降 50%，只有费氏链霉菌（S.fradiae）与立德链霉菌(S.rectus)等所产碱性蛋白酶经70处理 30min，酶活性仅损失 10-15%。我国生产的几种碱性蛋白酶的耐热性也在60以下。碱土金属，特别是钙对碱性蛋白酶有明显的热稳定作用。1.3.1.2 酶的结构和活性中心碱性蛋白酶的分子量在 20,00034,000 之间，等电点多为 89。大多数

25、微生物碱性蛋白酶作用于肽链，生成二个肽。除酶本身的氨基酸残基外，不具有特定的活性基团，酶发挥作用时不需要特定的激活剂，而需要金属离子激活，如除去金属离子就不能作用，必需的金属离子有 Mn2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Fe2+等。碱性蛋白酶属丝氨酸蛋白酶，除二异丙基氟磷酸(DFP)外，苯甲磺酰氟（PMSF）和其它磺酰卤化物，以及来自马铃薯、大麦、大豆的蛋白酶抑制剂可引起碱性蛋白酶的失活。1.3.1.3 碱性蛋白酶的专一性碱性蛋白酶的专一性决定于其自身结构，当它与不同底物结合时，首先形成一个非共价的酶底物复合物，它们靠物理引力维持在一起，接着丝氨酸的氢基对底物发黑龙江东方学院本科生毕业论文（

26、设计）5起攻击，产生四面体中间产物，然后中间产物破裂，形成酶产物复合物。微生物碱性蛋白酶具有强烈的酯酶活性，可水解甲苯磺酸基精氨酸甲酯（TAME）和各种对硝基苯基酯。枯草杆菌（B.subtlis）蛋白酶最佳的合成底物是乙酞基酪氨酸乙酯。碱性蛋白酶的专一性强烈地受到切开点两侧氨基酸残基，尤其是 P1-P4-氨基酸的影响，因此对天然底物的专一性甚广，它对酪蛋白的作用比对血红蛋白或牛血清蛋白更容易。根据微生物碱性蛋白酶对切开点羧基侧的专一性可将其分为四类：类似于胰蛋白酶的碱性蛋白酶，对碱性氨基酸如精氨酸、赖氨酸有专一性。对芳香族或疏水性氨基酸残基有专一性，如枯草杆菌碱性蛋白酶。对小分子脂肪族氨基酸残

27、基有专一性，如粘细菌一裂解型蛋白酶，这是一种溶解细菌细胞壁的蛋白酶。对酸性残基有专一性，如葡萄球菌碱性蛋白酶。1.3.2 碱性蛋白酶的酶学性质1.3.2.1 PH 对碱性蛋白酶的影响目前分离到的大多数碱性蛋白酶最适作用的 pH 范围为 9.0-10.0，仅少数超过11.0，甚至达到 pH12.0，且酶活力一般在碱性范围内比较稳定。Kanekar 等报道，从一碱性湖泊中分离得到两株产碱性蛋白酶菌株A.ramosus 及 B.alcalophilus，65下，前者分泌的蛋白酶最适 pH 为 11.0，后者分泌的蛋白酶酶为 10.0。两种酶在 pH7.0-12.0 范围内水解蛋白质的活力都十分稳定1

28、1。1.3.2.2 温度对碱性蛋白酶的影响碱性蛋白酶的温度适应范围较广，最适作用温度一般在 3075之间。有的低温酶在 20以下的低温仍能保持较高的活性，孙谧等报道的低温碱性蛋白酶在 20时的酶活性保持在 50%以上12。目前国内已报道的高温碱性蛋白酶产生菌株中，黄红英等报道的碱性蛋白酶最适温度为 60，60保温 30min 剩余 40%左右的酶活；刘成圣等报道的碱性蛋白酶最适温度 5060，60保温 30min 酶活剩余 50%；Kunamneni Adinarayana 等人研究了枯草芽孢杆菌 PE-11 的热稳定性，研究表明，该酶在 60处理了 350 min 酶仍保持 100%活力13

29、。1.3.2.3 有机试剂及金属离子对碱性蛋白酶的影响黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计）6大多数微生物碱性蛋白酶的活性中心含有丝氨酸，属于丝氨酸蛋白酶。当遇到作用于丝氨酸的试剂二异丙基氟磷酸(DFP)便失活，这是碱性蛋白酶的一个重要特征。碱性蛋白酶对金属螯合剂 EDTA、重金属和巯基试剂却不敏感，但也有例外，王宇婧等研究 Pb2+、Ag+、Cu2+对 YS-80-122 海洋低温碱性蛋白酶有抑制作用，EDTA 对其有强烈抑制作用14。大多数碱性蛋白酶发挥作用时不需要特定的激活剂，但是需要金属离子激活，必须的金属离子有 Mn2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Fe2+等，Ca2+对碱性蛋白酶有

30、稳定作用。同一金属离子对不同碱性蛋白酶的影响是不同的，或是激活、或是抑制、或是影响。1.3.3 碱性蛋白酶国内外的研究现状及应用碱性蛋白酶(Alkaline protease)广泛存在于微生物中，最早发现在猪的胰脏中，1913 年 Rhom 首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。1945 年瑞士的 Dr.Jagg 等发现了微生物碱性蛋白酶，使其成为洗涤剂的主要添加剂之一。碱性蛋白酶在丝绸、制革工业、饲料工业、动物食品加工中也有广泛用途，如添加到动物饲料中以提高饲料利用率；用于制作海鲜调味品；用于 CGM(玉米渣)的水解，以制取玉米饮料；水解大豆蛋白生产大豆多肽等。由于市场的需求，高产、高效、耐高温

31、、耐高碱的四高型碱性蛋白酶成为国内外当前研究的热点。随着科学技术的进步，地衣芽孢杆菌所产的胞外酶也日益被广泛研究应用。据报道，此酶可降解某些复杂的植物性碳水化合物如果胶,羧甲基纤维素，多聚半乳糖醛酸等。因此如果将地衣芽孢杆菌发酵生产的蛋白酶广泛应用并用于工业化生产，将会对人类有重大的意义。1.4 本文的目的意义及主要研究内容1.4.1 本文的目的意义本研究针对国内外应用微生物蛋白酶对大豆蛋白进行去酰胺改性的研究较少，现有微生物蛋白酶的去酰能力较低，对功能性的影响不大等现状，对地衣芽孢杆菌 2709的突变菌株 B. licheniformis SDL-9 的产酶条件以及该蛋白酶的酶学性质进行了研

32、究，以期为高去酰胺活性碱性蛋白酶的发酵生产及应用奠定理论基础，为大豆蛋白的改性提供一条新途径，对食品加工业的发展具有积极的作用。1.4.2 主要研究内容1.4.2.1 产酶条件的优化黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计）7主要从接种量、碳源、氮源、诱导物、起始 pH 值、温度、以及通气量等方面入手，以酶液对大豆蛋白的去酰胺度和肽键水解度为指标，对 B. licheniformis SDL-9 发酵产酶的发酵条件进行优化。1.4.2.2 高去酰胺碱性蛋白酶酶学性质的研究通过实验确定该高去酰胺活性碱性蛋白酶的最适反应温度、最适 pH，并对该酶的热稳定性、pH 稳定性以及表面活性剂、金属离子对酶活性的

33、影响等基本酶学性质进行研究。黑龙江东方学院学士学位毕业论文（设计）8第 2 章 材料与方法2.1 试验材料与仪器2.1.1 菌株地衣芽孢杆菌(B. licheniformis )SDL-9，B. licheniformis2709 的突变株，本实验保藏。2.1.2 培养基斜面培养基（%）：牛肉膏 1.0，蛋白胨 1.0，NaCl 0.5，琼脂 2.0，pH 7.2。平板培养基（%）：牛肉膏 0.5，蛋白胨 1.0，NaCl 0.5，琼脂 1.5，pH 7.2。种子培养基（%）：葡萄糖 1.0，蛋白胨 0.5，酵母膏 0.5，NaCl 0.5，pH 7.2。发酵培养基 （%）： 可溶性淀粉 1.

34、0，麸皮 1.0，黄豆饼粉 2.0，酵母膏2.0，Na2HPO40.2，KH2PO4 0.1，CaCO3 1.0 ，pH 7.2。2.1.3 主要试剂大豆分离蛋白（A 型） 哈高科大豆食品公司 茚三酮 分析纯 北京亚太龙兴化工有限公司甘氨酸 分析纯 天津市大陆化学试剂厂果 糖 生化试剂 北京市旭东化工厂硼 酸 分析纯 天津市大陆化学试剂厂谷氨酰胺 生化试剂 中国惠世生化试剂有限公司黄豆饼粉、玉米粉、麸皮均为市售；2.1.4 主要仪器设备KYC-100 型恒温摇床 北京晨曦勇创科技有限公司LRH-250 生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司DHG-9140A 型电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有

35、限公司CL-32L 自动高压灭菌器 日本 ALPSW-LJ-2FD 型超净工作台 苏州净化设备有限公司TGL-16 型台式高速冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司BS223S-Max 型电子天平 北京赛多利斯仪器有限公司LD5-2A 型低速离心机 北京医用离心机厂S-54 型紫外可见分光光度计 上海棱光技术有限公司制造黑龙江东方学院学士学位毕业论文（设计）92.2 试验方法2.2.1 粗酶液的制备将地衣芽孢杆菌 B. licheniformis SDL-9 斜面菌种从冰箱中取出，转接活化，然后接种到装有 30mL 种子培养基的 100mL 三角瓶中，30、140r/min 摇床振荡培养 12h作

36、为种子液，再按 2%的接种量接种于装有 35mL 发酵培养基的 100mL 三角瓶中，35、200r/min 摇床发酵 48h 后，10,000r/min 离心 10min，取上清液，即得粗酶液。2.2.2 测定方法2.2.2.1 去酰胺度测定方法用 Conway 和 OMalley(1942)的微量弥散皿法15。总酰胺氮含量的测定：取1mL1%的蛋白溶液，与0.25mL 12mol/L HCl 混合，再加入 0.25mL 水封于硬质玻璃管中，在125下水解3h，水解完毕后取出，待冷后打开玻璃管。在微量弥散皿中央加入3mL 吸收剂，外围加入1.2mL 样品，用薄膜覆盖，留一定空隙，在外围再加入

37、40%NaOH 溶液3mL。立即封上薄膜避免漏气；轻轻摆动，使外围的样品与NaOH 溶液充分混合，平放桌上反应2.5h；揭开薄膜后用0.01mol 的标准盐酸溶液滴定至略带微红，记录消耗盐酸的体积，按下式计算酰胺氮含量。计算：WN=NHCLVHCL/WT式中： WN总酰胺氮含量，mmol/g 蛋白质；NHCL标准盐酸的浓度，取0.01063mol/L；VHCL消耗标准盐酸的体积，mL；WT样品中蛋白质的含量，g酶解酰胺氮含量的测定：在微量弥散皿中央加入2ml 含甲基红-溴甲酚绿指示剂的2%的硼酸作为吸收剂，外围加入20ml 0.5%的大豆分离蛋白的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10.0） ，再在

38、外围加入 0.5mL 0.2%的酶液，迅速用水溶性胶封住弥散皿， 27放置36h 以释放氨气。吸收剂用0.0106mol 的标准盐酸溶液滴定至略带微红，记录消耗盐酸的体积。计算：CN=NHCLVHCL/WT式中， CN酶解酰胺氮含量，mmol/g 蛋白质； NHCL标准盐酸的浓度，取0.0106mol/L； VHCL消耗标准盐酸溶液的体积， mL；黑龙江东方学院学士学位毕业论文（设计）10 WT样品中蛋白质的含量，g去酰胺度计算：去酰胺度（%）= （WNCN）/ WN1002.2.2.2 肽键水解度(DH)的测定测定采用茚三酮比色法16。水解度的定义：蛋白质的水解度 DH（Degree of

39、hydrolysis）代表蛋白质在水解过程中，肽键被裂解的程度或百分比，数学表达式为：%100DHtothh式中：h 是被裂解的肽键数，htot是原蛋白质中的总肽键数，这里的 h 和 htot单位经常用 mmol/g 表示。对于一个特定的蛋白质，htot是一个常数，一般采用文献中的经验值，比如：大豆蛋白质的 htot值为 7.8 mmol/g，酪蛋白的 htot值为 8.2 mmol/g，也可以根据蛋白质中氨基酸的组成成分计算得到。(1)标准曲线的制作 取 0.1000g 干燥过的甘氨酸溶于蒸馏水后定容至 100mL，取溶液 5.0mL 定容至 100mL，得 50g/mL 的溶液，再取此溶液

40、稀释成含量为2.527.5g/mL 的溶液用于标准曲线的绘制。各取 2.0mL 稀释液于具塞刻度试管中，分别加入 1.0mL 茚三酮显色剂，混匀后置于沸水浴中加热 15min，在冷水中冷却，加入 5mL 50%乙醇溶液混匀，放置 15min，同时作空白试验，用 1cm 比色杯以空白管调零于 570nm 处测定吸光值。以吸光值为纵坐标，甘氨酸浓度为横坐标，制作标准曲线。(2)样品的测定 将水解蛋白液适当稀释后，取 2mL 稀释液于试管中并加入 1.0mL茚三酮显色剂，混匀后置于沸水浴中加热 15min，同时作空白试验；以后操作同标准曲线。利用标准曲线计算水解蛋白液中-NH2基的含量(mmol/m

41、L)。水解度的计算公式如下：%100DHtothh %100)g/mmol(L/gL/molmNH-L/molmNH-tot22h）度（水解前蛋白质溶液的浓）含量（原料蛋白中游离）含量（水解液式中：DH肽键水解度；黑龙江东方学院学士学位毕业论文（设计）11h水解后每克蛋白质被裂解的肽键毫摩尔数（mmol）-NH2；htot每克原料蛋白质的肽键毫摩尔数（mmol） ，大豆蛋白取 7.8；2.2.2.3 蛋白质含量的测定 采用半微量凯氏定氮法17。2.2.3 高去酰胺碱性蛋白酶产酶条件的优化2.2.3.1 生长曲线的测定将供试菌株单菌落接种于种子培养基中，30、140r/min 摇床振荡培养过夜后

42、，按 2%的接种量分别转接到 16 个装有 15mL 种子培养基的 50mL 三角瓶中，30、140r/min 条件下，摇床振荡培养 30h，每隔 2h 取出一瓶，适当稀释后测定其在 600nm下的吸光值，绘制种子生长曲线，得出对数生长期。2.2.3.2 接种量对产酶的影响将培养 12h 的种子液分别以 1%、2%、3%、4%、5%的接种量转接于 30mL 发酵培养基中，发酵产酶，以去酰胺度和肽键水解度为指标，观察不同接种量对产酶的影响。2.2.3.3 碳源对产酶的影响分别以 1%的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、糊精和玉米粉代替基础发酵培养基中的碳源，以 2%接种量接种 SDL-9 种子液，30、14

43、0r/min 摇床振荡培养 48h，10,000r/min离心 10min 取上清液，测定其去酰胺度和肽键水解度，比较不同碳源对产酶的影响。2.2.3.4 氮源对产酶的影响采用 2%的玉米粉为碳源，分别以 2%蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、氯化铵、硫酸铵、尿素、大豆蛋白和酪素代替基础发酵培养基中的氮源，以 2%接种量接种 SDL-9种子液，30、140r/min 摇床振荡培养 48h，10,000r/min 离心 10min 取上清液，测定其去酰胺度和肽键水解度，比较不同氮源对产酶的影响。2.2.3.5 诱导物谷氨酰胺对产酶的影响分别在发酵培养基中加入 0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.

44、5%谷氨酰胺做为诱导物，以 2%接种量接种 SDL-9 种子液，30、140r/min 摇床振荡培养 48h，10,000r/min 离心 10min 取上清液，测定其去酰胺度和肽键水解度，以未加谷氨酰胺的为对照，研究诱导物谷氨酰胺对产酶的影响。2.2.3.6 起始 PH 值对产酶的影响黑龙江东方学院学士学位毕业论文（设计）12将发酵培养基的 pH 值分别调节为 4.010.0，以 2%接种量接种 SDL-9 种子液，30、140r/min 摇床振荡培养 48h，10,000r/min 离心 10min 取上清液，测定其去酰胺度和肽键水解度，考察起始 pH 值对产酶的影响。2.2.3.7 温度

45、对产酶的影响在不同温度下(25、30、35、40、45、50、55)140r/min 摇床振荡培养，48h 取上清测定其去酰胺度和肽键水解度，考察不同温度对产酶的影响。2.2.3.8 装液量对产酶的影响在 100mL 三角瓶中分别装入15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL、50mL 的发酵培养基，30、140r/min 摇床振荡培养 48h，10,000r/min 离心 10min 取上清液，测定其去酰胺度和肽键水解度，考察不同通气量对产酶的影响。2.2.3.9 摇床转速对产酶的影响以 2%接种量接种 SDL-9 种子液于发酵培养基中，调整摇床转速在100r/mi

46、n240r/min 范围内进行发酵产酶，测定粗酶液的去酰胺度和肽键水解度，考察摇床转速对产酶的影响。2.2.4 高去酰胺碱性蛋白酶酶学性质的研究2.2.4.1 酶的最适作用温度用 pH 10.0 的碳酸钠碳酸氢钠缓冲液适当稀释粗酶液，并配制 pH 10.0 的 1%大豆分离蛋白溶液，分别在 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60的温度下测定去酰胺度。以去酰胺度为纵坐标，反应温度为横坐标，绘制酶反应温度曲线，确定酶的最适作用温度。2.2.4.2 酶的最适作用 PH 值在 pH 值为 412 范围内，向酶反应体系中分别添加相差 1 个 pH 单位的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液(pH

47、46)、磷酸盐缓冲溶液 (pH 78)、碳酸钠碳酸氢钠缓冲溶液(pH 911)和磷酸氢二钠氢氧化钠缓冲溶液(pH 12.0)，在最适反应温度下，测定去酰胺度。以去酰胺度为纵坐标，反应 pH 值为横坐标，绘制酶反应 pH 值曲线，确定酶的最适作用 pH 值。2.2.4.3 酶的热稳定性将酶液分别于 40、50、60、70、80的水浴中保温，每隔 20 min 取样在黑龙江东方学院学士学位毕业论文（设计）13最适反应温度、反应 pH 值的条件下，测定去酰胺度，以未保温的去酰胺度为 100%，其余折合成剩余的百分数，绘制相对去酰胺度-保温时间曲线。2.2.4.4 酶的 PH 稳定性将粗酶液与不同 p

48、H 值(311)的缓冲液按 11 的体积比混合，于 30保温 2h 后，测定去酰胺度，以在最适反应 pH 下保温所测定的酶活力为 100%，其余折合成剩余的百分数，以此对保温 pH 作图，便可得到该酶在上述条件下的 pH 稳定曲线。2.2.4.5 金属离子对该酶去酰胺能力的影响在酶反应体系中加入不同的金属离子(K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+)，使其终浓度达到 5mmol/L，并保温 20min，测定去酰胺度，以未加金属离子的去酰胺度为 100%，计算加入不同金属离子的残余酶活力，研究金属离子对该酶去酰胺能力的影响情况。2.2.4.6 表面活性剂浓度对该

49、酶去酰胺能力的影响在酶反应体系中添加不同浓度(1%5%)的 Tween-80，测定去酰胺度。用不加Tween-80 的为对照，以浓度为横坐标，以去酰胺度为纵坐标作图，研究表面活性剂对该酶去酰胺能力的影响情况。黑龙江东方学院学士学位毕业论文（设计）14第 3 章 结果与分析3.1 高去酰胺碱性蛋白酶产酶条件的优化3.1.1 SDL-9 种子生长曲线将 SDL-9 培养液于在 30、140r/min 条件下，摇床振荡培养 32h，定时取样测定发酵液在 600nm 下的吸光值，绘制种子的生长曲线，见图 3-1。由图 3-1 可见，SDL-9的对数生长期为 616 小时。图 3-1 突变株 SDL-9

50、 种子生长曲线3.1.2 接种量对产酶的影响将培养 12h 的种子液分别以 1%5%的接种量转接于 30mL 发酵培养基中，发酵产酶，测定粗酶液的去酰胺度和肽键水解度，结果见图 3-2。图 3-2 接种量对 SDL-9 产酶的影响由图 3-2 可以看出，接种量对菌种发酵产酶肽键水解度的影响不大，而对去酰胺度的影响相对较大，接种量为 2%时去酰胺度最高，而接种量过低或过高对产酶的去酰胺能力均不利，可能原因是接种量过低时，由于菌种生长不好而影响酶的生物合成，接种量过大由于菌种生长过于旺盛，培养基营养成分消耗太快，有些初级代谢产物或次级代谢产物的产生对酶合成有抑制作用。00.10.20.30.40.

51、50.60246810121416182022时间/hOD值424344454647480123456接种量/%去酰胺度/%12131415161718肽键水解度/%去酰胺度肽键水解度黑龙江东方学院学士学位毕业论文（设计）153.1.3 碳源对产酶的影响分别以葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、糊精、可溶性淀粉和玉米粉作为碳源，发酵产酶，测定粗酶液的去酰胺度和肽键水解度，结果见图 3-3。图 3-3 不同碳源对 SDL-9 产酶的影响培养基碳源主要为微生物生长提供能量和细胞骨架，不同碳源对产酶贡献是不一样的。通常情况下，易利用碳源有利于微生物生长，而缓慢分解的碳源有利于产酶。从图 3-3 可以看出，以玉米粉

52、作为碳源时产酶的去酰胺度最高，其次为可溶性淀粉，且前者的肽键水解度略低于后者。同时还可以看出，易利用碳源如葡萄糖、麦芽糖等作为碳源时对产酶有一定的抑制作用，产酶的去酰胺度和肽键水解度都较低，这可能是由于代谢产物的阻遏作用。考虑到我们要选择的是去酰胺能力强，而肽键水解能力弱的产酶条件，所以我们选择玉米粉为最佳碳源。3.1.4 氮源对产酶的影响分别以氯化铵、硫酸铵、尿素、牛肉膏、大豆蛋白、酪素、黄豆饼粉及蛋白胨为氮源，发酵产酶，测定粗酶液的去酰胺度和肽键水解度，结果见图 3-4。图 3-4 不同氮源对 SDL-9 产酶的影响从图 3-4 可以看出，不同氮源对碱性蛋白酶的去酰胺能力和肽键水解能力的贡

53、献01020304050葡萄糖麦芽糖蔗糖糊精可溶性淀粉玉米粉%去酰胺度肽键水解度0102030405060氯化铵硫酸铵尿素牛肉膏大豆蛋白酪素黄豆饼粉蛋白胨%去酰胺度肽键水解度黑龙江东方学院学士学位毕业论文（设计）16不同。以牛肉膏作为氮源的去酰胺度最高为 50.58%，其次是大豆蛋白为 50.24%，而以大豆蛋白为氮源的肽键水解度要低于以牛肉膏为氮源的，而又考虑到大豆分离蛋白的生产规模大、价格低等因素，所以选择大豆蛋白作为最佳氮源。3.1.5 诱导物谷氨酰胺对产酶的影响在发酵培养基中加入 0.3%1.5%的谷氨酰胺做为诱导物，发酵产酶，以未加诱导物的为对照，测定粗酶液的去酰胺度和肽键水解度，结

54、果见图 3-5。图 3-5 谷氨酰胺对 SDL-9 产酶的影响由图 3-5 可见，谷氨酰胺对菌株产酶的去酰胺能力有明显的促进作用，并随着含量的增加而增大，到 0.9%时去酰胺度达到最高为 56.61%，以后变化不明显；但谷氨酰胺诱导物对其肽键水解度的影响不显著。故选择诱导物谷氨酰胺的添加量为 0.9%。3.1.6 起始 pH 值对产酶的影响将发酵培养基的 pH 值分别调节为 410，发酵产酶，测定粗酶液的去酰胺度和肽键水解度，结果见图 3-6。图 3-6 起始 pH 对 SDL-9 产酶的影响由图 3-6 可以看出，培养基起始 pH 值对发酵产酶的去酰胺度和肽键水解度影响较大，pH 值为 7

55、时去酰胺度最高，pH 值为 68 时肽键水解度较高，且相差不大。考虑到我们要选择的是去酰胺能力强而肽键水40455055600.00.30.60.91.21.5浓度/%去酰胺度/%510152025肽键水解度/%去酰胺度肽键水解度5152535455534567891011起始pH值去酰胺度/%510152025肽键水解度/%去酰胺度肽键水解度黑龙江东方学院学士学位毕业论文（设计）17解能力弱的发酵条件，所以培养基起始 pH 值为 7.0 时产酶效果最好，为最适 pH 值。3.1.7 发酵温度对产酶的影响按照以上得到的结果，配制发酵培养基，分别于 2555下，发酵产酶，测定其去酰胺度和肽键水解

56、度，结果见图 3-7。图 3-7 发酵温度对 SDL-9 产酶的影响培养温度能够显著影响微生物的生长速率和代谢途径，过高或过低的培养温度都会影响生物体内的活性，从而影响产物的合成。由图 3-7 可见，发酵温度为 35时去酰胺度最高，而肽键水解度相对较低，故为最适发酵温度。3.1.8 不同装液量对产酶的影响在 100mL 三角瓶中分别装入不同体积的培养基，发酵产酶，测定粗酶液的去酰胺度和肽键水解度，结果见图 3-8。 图 3-8 装液量对 SDL-9 产酶的影响由图 3-8 可以看出，装液量对菌株 SDL-9 发酵产酶的去酰胺度和肽键水解度的影响较大。30mL/100mL 装液量时菌种产酶的去酰

57、胺度最高，但肽键水解度也较高；而35mL/100mL 装液量时菌种产酶的去酰胺度也较高，且肽键水解度相对较低，故最佳装液量为 35mL/100mL。3035404550556010152025303540455055装液量/mL去酰胺度/%51015202530肽键水解度/%去酰胺度肽键水解度303540455055202530354045505560温度/去酰胺度/%51015202530肽键水解度/%去酰胺度肽键水解度黑龙江东方学院学士学位毕业论文（设计）183.1.9 摇床转速对产酶的影响调整摇床转速在 100r/min240r/min 范围内进行发酵产酶，测定粗酶液的去酰胺度和肽键水解

58、度，结果见图 3-9。图 3-9 摇床转数对 SDL-9 产酶的影响由图 3-9 可见，摇床转速对菌株 SDL-9 发酵产酶的去酰胺度和肽键水解度的影响较大。转速为 220r/min 时去酰胺度最高(61.51%)，其次是 200r/min(61.16%)，且二者相差不大，考虑到摇床本身的情况，故选择 200r/min 为最佳摇床转速为。3.2 高去酰胺碱性蛋白酶酶学性质的研究3.2.1 酶的最适作用温度分别在不同温度(1560)下测定酶液去酰胺度，结果见图 3-10。由图 3-10 可知， 40时该酶的去酰胺度最高，为最适作用温度，在 3545之间该酶均具有较高去酰胺能力，60时该酶的去酰胺

59、能力较低。25303540455055606515202530354045505560温度/去酰胺度/%图 3-10 温度对酶促反应的影响3.2.2 酶的最适作用 pH 值在不同 pH 值(412)的缓冲体系中进行酶促反应，测定去酰胺度，结果见图 3-11。由图 3-11 可以看出，pH 对该酶的去酰胺度影响较大，酸性条件(pH46)下该酶3540455055606580100120140160180200220240260转数/rpm去酰胺度/%5101520253035肽键水解度/%去酰胺度肽键水解度黑龙江东方学院学士学位毕业论文（设计）19的去酰胺能力较弱，碱性条件(pH811)下该酶的

60、去酰胺能力较强，说明该酶具有较强的耐碱性，其中 pH 值为 9 时该酶的去酰胺能力最强，为最适作用 pH。253035404550556045678910111213pH去酰胺度/%图 3-11 pH 对酶促反应的影响3.2.3 酶的热稳定性将适当稀释的酶液分别在不同温度(4080)下保温 2h，每隔 20min 取样，测定酶促反应的去酰胺度，结果见图 3-12。由图 3-12 可以看出，该酶在 40保温 2h，去酰胺能力下降不明显，保留了 80%以上；在 50下保温 2h 后相对去酰胺度降至52.3%；60保温 2h 后去酰胺能力仅存 5.4%；而在 70下保温 60min 和 80下保温4