生物质谱与二维核磁共振技术对中华眼镜蛇

1、生物质谱与二维核磁共振技术对中华眼镜蛇毒神经毒素活性多肽片段的序列分析与结构测定 项目完成人：应万涛 李蕾 王杰 桑志红 钱小红项目完成单位：国家生物医学分析中心一、课题简介蛇毒（Snake venom）是毒蛇的唾液腺中分泌出来的一种毒液，含有复杂的毒性蛋白质毒素，还含有多种重要的酶类，其中的蛋白质和酶类约占其干重的90-95%，此外还含有一些小分子肽、氨基酸、碳水化合物、脂类、核苷、生物胺类及金属离子。由于蛇毒在生物科学和医学研究中的广泛应用，引起国内外生物学和医药学界的重视。蛇毒中多种蛋白质和多肽可以用来治疗毒蛇攻击患者。此外对蛇毒的研究也有助于发现抗血拴形成的药物。蛇毒全蛋白冻干粉双向电

2、泳分离胶内酶切肽段提取已知蛋白未知蛋白LC-MS/MS蛇毒蛋白质组数据库重要蛋白质（酶）功能发掘MALDI-TOF/MS肽指纹谱+数据库检索图1：蛇毒蛋白质组分析流程图传统的蛇毒分离手段有离子交换、凝胶过滤、高效液相色谱等，虽然取得了很多进展，但这些方法往往局限于某种或某类蛋白质，而忽略了大部分蛋白质。最新的蛋白质组研究技术，包括双向电泳分离、图像分析、肽质量指纹谱和肽序列标签质谱鉴定，以细胞、细胞或整个生物体所表达的全部蛋白质为研究对象，从而使蛋白质研究达到高通量化和规模化。在本课题中，首次蛋白质组研究技术手段对环蛇属（金环蛇，银环蛇，眼镜蛇）、腹蛇属（尖吻腹，烙铁头）等两个种属的五种毒蛇的

3、蛇毒全蛋白进行研究，获得了初步的结果。 二、实验方案1 硬件设施冰冻干燥机SpeedVac (Savant)等电聚焦仪 IPGphor （Amersham Science） 垂直电泳仪Protean II（Bio-Rad）切胶仪Spot picker（Amersham Science）基质辅助激光解吸附飞行时间质谱仪（MALDI-TOF/MS，Reflex III, Bruker）液相色谱串联质谱（Q-TOF 2，Micromass）2.该课题的实验设计流程图如图1所示。包括以下几个方面：. 利用双向凝胶电泳分离蛇毒总蛋白。针对部分蛋白质点密集区域，一向等电聚焦选用窄范围干胶条（pH4-7）；

4、.将通过考马斯亮蓝染色后的双向电泳凝胶上的蛋白质点，全部用自动切胶仪切下，进行胶内酶切提取肽段，采用MALDI-TOF/MS的肽质量指纹谱技术进行鉴定；.对未能鉴定出来但谱图很好的蛋白质点，尝试利用串联质谱肽序列标签技术进行鉴定。三、课题结果1 利用双向凝胶电泳技术分离获得环蛇属（金环蛇，银环蛇，眼镜蛇）、腹蛇属（尖吻腹，烙铁头）等两类五种毒蛇毒液的全蛋白质表达谱，不同种属蛇毒表达谱对比结果显示，环蛇属表达蛋白质主要分布在20Kd至6Kd的低分子量区域，而腹蛇属的蛋白质分布范围广泛，分别在40Kd及15Kd的区域表达蛋白质较多。由于尖吻腹蛇毒在酸性区蛋白质点比较集中，因此在pH3-10分离的基

5、础上进一步采用pH4-7的一向干胶条进行双向电泳分离，结果证实这种方法的有效性，全部的双向电泳图谱见图2。图2：蛇毒全蛋白双向电泳图谱（非特殊说明，分离条件均为pH3-10，13.5%聚丙烯酰胺二向凝胶，考马斯亮蓝染色）。上：左银环蛇，中金环蛇，右眼镜蛇下：左烙铁头，中尖吻腹，左尖吻腹（pH4-7）2 从考马斯亮蓝染色的双向电泳凝胶上切下蛋白质点，利用生物质谱肽质量指纹谱技术鉴定276个蛋白质，均获得高质量的质谱图谱，将肽指纹谱数据递图3:蛋白质点Si的肽质量指纹图谱，数据库检索显示该蛋白质为磷酯酶A2 (环蛇毒素A1链)交网络数据库检索后鉴定出8个蛋白质（如图3示）。3 利用生物质谱肽序列标

6、签技术获得1个蛋白质点的串联质谱图，并读出三个肽段序列，但是网络数据库检索后没有得到明确结果，说明该蛋白质点可能代表一个新蛋白（图4），鉴于肽质量指纹谱方法所鉴定的蛋白质太少，提示通过串联质谱测序可以获得更多新的蛇毒蛋白质序列。图4:双电荷离子690.38的串联质谱图谱，由该图谱可以读出的肽序列标签为-LEMMLFTE-四、结论该课题首次运用蛋白质组技术手段分离获得了不同种属蛇毒的蛋白质表达谱，该表达谱显示出了蛇毒的种属和特异性，提示通过蛋白质组手段对未知蛇毒分类的可行性。质谱鉴定的结果表明蛋白质组学完全可以应用到蛇毒蛋白质资源的大规模开发中。但由于网络数据库中蛇毒蛋白质数量有限，而且目前为止

7、没有毒蛇基因组的研究公布出来，因此，不像人类蛋白质组的研究，蛇毒蛋白质的生物质谱鉴定缺乏蛋白质数据库和全基因组序列的支持。正是因为如此，在本研究中虽然获得了很好的双向电泳图谱和质谱图谱，但质谱鉴定的结果却不尽如意。可以预见，如果与大规模基因组测序相结合，从蛇毒中开发有应用价值成份的步伐也将大大加快。参考文献1覃公平：中国毒蛇学. 南宁：广西科学技术出版社, 19982 蛇类保护与利用培训班讲义. 浙江医科大学蛇毒研究组编，19873 Borchers C, Peter JF, Hall MC et al. Identification of in-gel digested proteins by complementary peptide mass fingerprinting and tandem mass spectrometry data