液相基础知识

1、HPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC的环境设置：HPLC Business DeptShimadzu Corporation一、色谱起源一、色谱起源石油石油醚醚碳酸碳酸钙颗钙颗粒粒色素色素色色谱谱组组分分HPLC Business DeptShimadzu Corporation液相色谱流程图输输液液泵泵进样进样器器色色谱

2、谱柱柱柱温箱柱温箱检测检测器器溶溶剂剂数据数据处处理理HPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLCHPLC的分离类型的分离类型HPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC Business DeptShimadzu Corporation正相正相HPLC HPLC 色色谱谱柱柱Silica gelSiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)Modified SiHPLC Business DeptShimadzu Corporatio

3、n反相反相HPLC HPLC 色色谱谱柱柱-Si-C18H37SiHPLC Business DeptShimadzu Corporation流动相流动相选择注意事项：流动相选择注意事项：纯度：采用纯度：采用“ “ HPLC ” ”级溶剂级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂剂对试样有适宜的溶解度对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小溶剂粘度要小与检测器相匹配与检测器相匹配流动相配制时的顺序流动相配制时的顺序HPLC Business DeptShimadzu Corporation溶溶 剂剂 等等 级级水的等级水的等级纯化水纯化水蒸馏水蒸馏水去离子

4、水去离子水波长波长 (nm)纯化水纯化水去离子水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物纯化水中去除了无机和有机的污染物HPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC用水可以通过以下几个方面来得到：HPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC Business DeptShimadzu Corporation溶剂前处理 过滤：过滤：0.45um0.45um或更小孔径滤膜或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱目的：除去溶剂中的微小

5、颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。HPLC Business DeptShimadzu Corporation30mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.22m和0.45m两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50l。13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.22m和0.45m两种规格,材料为纤维素。3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.22m和0.45m两种规格。处理样品体积为7l。样品过滤头的类型：样品过滤头的类型：HPLC Business DeptShimadzu Corporation滤膜类型滤膜类型：聚四氟乙

6、烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸,70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。HPLC Business DeptShimadzu Corporation溶剂前处理 脱气脱气 目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡泡 一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能容纳的空气总量要小溶剂所能容纳的空气

7、总量要小 气泡对测定的影响：气泡对测定的影响： 1 1）柱压波动，流量偏小）柱压波动，流量偏小 2 2）基线波动）基线波动 返回HPLC Business DeptShimadzu Corporation柱塞往复泵单单向向阀阀马马达和凸达和凸轮轮柱塞杆柱塞杆柱塞杆密封圈柱塞杆密封圈泵头泵头10 -100uLHPLC Business DeptShimadzu Corporation岛津VP系列输液泵目的目的 单元单元 流速范围流速范围特性和应用特性和应用 分析分析 LC-10ADLC-10ADVPVP0.001-9.9990.001-9.999无脉动，适于无脉动，适于半微量半微量LC LC 和

8、和 LC-MSLC-MS LC-10ATLC-10ATVPVP0.001-9.9990.001-9.999非凡的耐用性，非凡的耐用性， 适于常量分析适于常量分析*所有单元都既可做高压梯度又可做低压梯度所有单元都既可做高压梯度又可做低压梯度HPLC Business DeptShimadzu Corporation等度洗脱输输液液泵泵进样进样器器色色谱谱柱柱柱温箱柱温箱检测检测器器HPLC Business DeptShimadzu Corporation梯度洗脱 A 泵泵进样进样器器色色谱谱柱柱柱温箱柱温箱检测检测器器 B泵泵AB时间时间B 浓浓度度HPLC Business DeptShim

9、adzu CorporationMeOH / H2O = 6 / 4MeOH / H2O = 8 / 2( column : ODS type )等度洗脱HPLC Business DeptShimadzu Corporation95%30%MeOH 浓浓度度梯度洗脱HPLC Business DeptShimadzu Corporation混合器混合器低低压压梯度比例梯度比例阀阀 高高压压梯度梯度低低压压梯度梯度脱气机脱气机高压/低压梯度系统HPLC Business DeptShimadzu Corporation返回高压梯度系统高压梯度系统梯度准确度好梯度准确度好系统复杂系统复杂 ( (

10、需两台或三台泵需两台或三台泵) )低压梯度系统低压梯度系统系统简单系统简单需在线脱气机需在线脱气机存在时间滞后效应存在时间滞后效应高压/低压梯度系统HPLC Business DeptShimadzu Corporation进样器自动进样器自动进样器手动进样器手动进样器 原理：（原理：（六通阀六通阀） 注入方式：注入方式： 1 1）全量注入全量注入 2 2）部分注入）部分注入返回HPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLCHPLC六通阀进样器的使用及保养六通阀进样器的使用及保养HPLC Business DeptShimadzu Corporation工

11、作原理工作原理HPLC Business DeptShimadzu Corporation手动进样器的原理图手动进样器的原理图 装填状态装填状态进样状态进样状态返回HPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC Business DeptShimadzu CorporationHPLC Business DeptShimadzu C

12、orporation进样进样体体积积 检检测测器器响响应应值值定量管体定量管体积积的一半的一半3倍定量管体倍定量管体积积全量注入全量注入部分注入部分注入进样体积与响应值关系进样体积与响应值关系返回HPLC Business DeptShimadzu Corporation泵的保养HPLC Business DeptShimadzu Corporation色谱柱1 1）柱压低于）柱压低于150kgf/cm2（15cm色谱柱）色谱柱）2 2）柱温在）柱温在40左右，最高使用温度为左右，最高使用温度为503 3）流动相）流动相PH使用范围为使用范围为27.5返回ODS柱的使用注意点：柱的使用注意点：

13、HPLC Business DeptShimadzu Corporation柱的保养：HPLC Business DeptShimadzu Corporation流动相注意点流动相注意点HPLC Business DeptShimadzu CorporationLC检测器检测器紫外可见检测器紫外可见检测器（UV/VIS）二极管阵列检测器二极管阵列检测器（PDA）示差检测器示差检测器（RID）电导检测器电导检测器（CDD）荧光检测器荧光检测器（RF）电化学检测器电化学检测器（L-ECD）质谱检测器质谱检测器（MS）蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器（ELSD） HPLC Business Dept

14、Shimadzu Corporation反相色谱分析时反相色谱分析时添加添加10-30 mM 三乙胺三乙胺(triethylamine) 可以抑制碱性化合可以抑制碱性化合物色谱峰拖尾物色谱峰拖尾 添加添加1% 醋酸醋酸acetic acid 可以抑制酸性化合物拖尾可以抑制酸性化合物拖尾三乙胺三乙胺(triethylamine) 也用于正相色谱中也用于正相色谱中,使硅胶部分去使硅胶部分去活性活性, 以获得化合物合适的保留时间以获得化合物合适的保留时间HPLC Business DeptShimadzu Corporation维护流程图吸滤头吸滤头单向阀单向阀柱塞密封圈柱塞密封圈线路过滤器线路过滤

15、器检测器检测器HPLC Business DeptShimadzu Corporation管线选择材料不锈钢 Teflon PEEK (聚醚醚酮)尺寸 0.1 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.3 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.5 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.8 mmI.D. x 1.6 mmO.D.HPLC Business DeptShimadzu Corporation管线材料不锈钢不锈钢 ( (可用于所有连接可用于所有连接) )能承受几千能承受几千 kg/cm2 压力压力酸性或高浓度盐环境中易腐蚀酸性或高浓度盐环境中易腐蚀 ( (尤其在尤其在pH

16、小于小于2 2时时) )PEEK ( (可用于所有连接可用于所有连接) )能承受高达能承受高达 250 kg/cm2压力压力可在整个可在整个PH范围范围(pH 1-14) )内使用内使用 不适用于高溶解性溶剂如氯仿等不适用于高溶解性溶剂如氯仿等Teflon ( (用于柱后阻尼管、反应管和排液管用于柱后阻尼管、反应管和排液管) )化学惰性大化学惰性大能承受能承受 5 kgf/cm2 压力压力HPLC Business DeptShimadzu Corporation接头不锈钢接头不锈钢接头 / / 垫圈垫圈 主要用于输液泵、进样器的连接主要用于输液泵、进样器的连接能承受能承受 400 kgf/c

17、m2压力压力一旦固定，垫圈不可再动一旦固定，垫圈不可再动PEEK接头接头 主要用于色谱柱、检测器的连接主要用于色谱柱、检测器的连接易于安装易于安装能承受能承受 250 kgf/cm2压力压力容易产生死体积容易产生死体积不锈钢接头垫圈PEEK接头HPLC Business DeptShimadzu Corporation吸滤头材料：不锈钢烧结，孔径材料：不锈钢烧结，孔径10um10um故障：堵塞故障：堵塞表现：管路中不断有气泡生成表现：管路中不断有气泡生成措施：用异丙醇（或措施：用异丙醇（或5稀硝酸），超声波清洗稀硝酸），超声波清洗，再用蒸馏水清洗，再用蒸馏水清洗HPLC Business De

18、ptShimadzu Corporation单向阀T泵：串联式往复泵泵：串联式往复泵D泵：并联式往复泵泵：并联式往复泵HPLC Business DeptShimadzu Corporation单向阀单向阀结构单向阀结构球座吸液冲程排液冲程出口单向阀进口单向阀泵头抛光面宝石球流动相单向阀原理单向阀原理HPLC Business DeptShimadzu Corporation单向阀清洗故障：宝石球或球座受污导致密封不好故障：宝石球或球座受污导致密封不好表现：系统压力波动大表现：系统压力波动大措施：措施：打开排液阀，以异丙醇为流动相输液打开排液阀，以异丙醇为流动相输液拆下单向阀，放入异丙醇中，超

19、声波清洗拆下单向阀，放入异丙醇中，超声波清洗HPLC Business DeptShimadzu Corporation故障故障1 1：宝石球粘附于垫片：宝石球粘附于垫片表现：泵无法吸液或排液，流路不通表现：泵无法吸液或排液，流路不通措施：措施：1 1）用针筒抽出口单向阀以产生负压）用针筒抽出口单向阀以产生负压，使宝石球与垫片分开，使宝石球与垫片分开 2 2）拆下单向阀，放入异丙醇或水中）拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波清洗，用超声波清洗单向阀粘结HPLC Business DeptShimadzu Corporation柱塞密封圈的更换故障：密封圈磨损导致密封不良故障：密封圈磨损导致密

20、封不良现象：系统压力波动大或漏液现象：系统压力波动大或漏液措施：更换密封圈措施：更换密封圈注意点：注意点：1 1）更换前，新密封圈用异丙醇）更换前，新密封圈用异丙醇 浸泡浸泡15 min2 2）拆卸泵头前，柱塞杆复位）拆卸泵头前，柱塞杆复位 （P PSETSET）流动相泵头清洗管路柱塞杆密封圈HPLC Business DeptShimadzu Corporation线路过滤器故障：堵塞故障：堵塞现象：系统压力波动大或压力现象：系统压力波动大或压力 偏高偏高措施：异丙醇（或措施：异丙醇（或5 5稀硝酸），稀硝酸）， 超声波清洗超声波清洗判断依据判断依据：关闭排液阀，断开出：关闭排液阀，断开出口

21、管路，设定流速口管路，设定流速1mL/min，如压力如压力5kgf/cm2，则堵塞。，则堵塞。排液阀压力传感器线路过滤器流动相HPLC Business DeptShimadzu Corporation 手动进样器操作注意点：操作注意点：1 1）进样时，进样针应插到底）进样时，进样针应插到底2 2）不使用时将针头留在进样器内）不使用时将针头留在进样器内3 3）进样应使用液相色谱专用平头）进样应使用液相色谱专用平头 进样针进样针4 4）样品溶液）样品溶液pH小于小于10, 常用密封常用密封垫的材质适用垫的材质适用pH10, 否则换特否则换特氟隆材质的密封垫氟隆材质的密封垫pH10-135 5）清

22、洗应使用专用针口清洗器）清洗应使用专用针口清洗器定子转子针头密封垫弹簧不锈钢套HPLC Business DeptShimadzu Corporation清洗针口HPLC Business DeptShimadzu Corporation色谱柱柱效降低原因滤片或填料滤片或填料堵塞堵塞样品或流动相中样品或流动相中杂质吸附杂质吸附机械振动机械振动产生空隙产生空隙填料变性填料变性HPLC Business DeptShimadzu Corporation滤片或填料堵塞使用预柱使用预柱缓冲液和溶剂使用缓冲液和溶剂使用0.45um滤膜过滤滤膜过滤样品溶液使用样品溶液使用0.45um滤膜过滤滤膜过滤反向连

23、接色谱柱，使用清洗溶剂以小流量送液反向连接色谱柱，使用清洗溶剂以小流量送液打开柱头，清洗或更换滤片打开柱头，清洗或更换滤片BackHPLC Business DeptShimadzu Corporation样品或流动相中杂质吸附杂质会产生拖尾峰杂质会产生拖尾峰使用高溶解性溶剂清洗色谱柱使用高溶解性溶剂清洗色谱柱仅仅 1 cm深度深度会被污染会被污染色谱柱取出污染填料，装填新的填料取出污染填料，装填新的填料HPLC Business DeptShimadzu Corporation机械振动产生空隙8945612370 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx000

24、 0000 0LC-10AD :输液时不要打开排液阀HPLC Business DeptShimadzu Corporation填料变性硅胶型硅胶型聚合物型聚合物型pH 范围范围2 - 7.5广泛使用广泛使用有机溶剂有机溶剂所有溶剂所有溶剂有限制有限制压力压力低于低于 250 kgf/cm2压力低压力低温度温度最好低于最好低于60可在高温下使用可在高温下使用HPLC Business DeptShimadzu Corporation产生峰变形（如拖尾等）的原因柱进口污染柱进口污染柱内存在空隙柱内存在空隙 样品过载样品过载溶解样品的溶剂选择不当溶解样品的溶剂选择不当二次保留效应二次保留效应担体表面存在硅醇基担体表面存在硅醇基担体表面残留重金属担体表面残留重金属HPLC Business DeptShimadzu Corporation溶解样品的溶剂选择不当最好不要选择高溶解性的试剂作为溶解样品的溶剂最好不要选择高溶解性的试剂作为溶解样品的溶剂甲醇 作为溶剂Caffeine乙醇 作为溶剂Caffeine乙醇 作为溶剂Caffei