FACSDiva操作说明

1、FACSDiva操作说明书首先熟悉一下Diva的操作界面1 通过点击菜单栏的相应的按钮，可以隐藏或展开相应的模块2 Browser通过Browser，可以对数据库进行管理，Browser列出了文件夹、实验、及实验所包含的样本和管子。 3 Acquisition control 对获取和记录数据进行操作4 Instrument 仪器设置仪器框显示了仪器连接状态，当打开一个实验，试管指向定位于一个试管时，这个框显示的是当前试管的仪器设置。5 浏览框 浏览框显示了 worksheet或者 Browser中选中的部件的属性，可进行修改。6 worksheetWorksheet框，可进行画图、设门、设逻

2、辑关系，进行统计等。7获取状态显示了获取或记录数据时的状态。在基本熟悉Diva的界面后，下面就进行一个实验。在Diva软件上进行操作，必须先新建一个实验（实验必须建立在文件夹中）。下面描述的是如何使用这些命令：Creating a Folder and an Experiment这部分描述了如何创建一个Practice文件夹和包含有基础分析的实验。1、在浏览框的菜单栏中单击2、重命名为Practice，如下图3、选择Practice文件夹，点击浏览框菜单栏的在文件夹下就创建了一个新的实验，这个实验包含了默认的仪器设置和一个空白的global worksheet。4、点及增加Specimen快捷

3、键，可加一个样本和试管。5、浏览框中点击左边的样本指向，指向tube-001。样本指向变成绿色，说明当前Expriment和Acquizition control中显示该tube的属性。6、在Browser中选择每一项，看看Inspector框的变化。当tube-001被选择时，在Inspector中可以看到有四个标签，分别点击看看变化。在这版软件中，一些仪器设置不能在Inspector中修改。当与流式细胞仪相连接时，可以在Instrument框中改变电压、域值和补偿。7、选择ExprimentExpriment Layout，对每个参数进行定义，如下图。当你的实验包含有很多试管时，你可以用E

4、xpriment Layout 来一次标记所有试管。8、在Expriment Layout 对话框中，点击Acquisition标签，选择Tube-001，改变计数粒子为10000，点击OK。当你在浏览框中选择Tube001时，在Inspector中的Labels和Acqui中的选项也随着改变。9、在Global worksheet中创建一个FSC vs SSC点图在worksheet菜单栏中点击，再在worksheet中点击一下，就创建了一个默认大小点图。10、在FSC vs SSC点图中边上创建一个PE直方图在worksheet菜单栏中点击直方图工具，再点击worksheet，一个默认大小

5、的直方图就建立好了。点击X轴标签，在下拉菜单中选择PE-A，可改变图的参数。注意参数的名字是你先前设定的参数名。11在FSC vs SSC点图下面创建一个FITC vs PerCP-Cy5.5的点图按住Ctrl键，点击FSC vs SSC图的边缘，往下拖。当你拖的时候，就创建了一个复制的点图。把点图放在合适的位置，松开鼠标，这个方法可以复制任何的点图。点击坐标轴，选择合适的参数。12创建一个Population HierarchyPopulation Hierarchy是用来列出定义的亚群。右击任何点图，选择Show Population Hierarchy，把结果图拖到FITC vs Per

6、CP-Cy5.5点图的右侧。Worksheet应该看起来类似于下图：Exporting an Experiment as a Template现在已经创建好一个实验了，可以导出成为一个模板。实验模板包括了样本、试管、关键词、仪器设置、标签、worksheet上的图以及worksheets（包括所有设置，如分页），但不包含有数据。 一个实验可以保存为一个模板，为了简化浏览框，模板不通过浏览框选择。1、在浏览框中选择Expriment-001，再选择FileExportExpriment Template。确定选择的是Expriment Template 命令，而不是Expriment命令。Exp

7、ort Experiment Template Wizard出现，对话框上的黑体字告诉你每个框的作用2在模板类型中输入Practice，模板名字中输入Simple Analysis。模板类型用来对类似的模板进行分组，以便于查找。当你在创建一个模板时，至少要输入类型和名字，后面的选项是可选项。3点击Next，可查看后面的选项，点击Finish。Creating an Experiment from a Template现在可以用原来保存的模板来创建一个实验。记住当你想在一个文件夹中创建一个实验时，首先要选择文件夹。1、选择Practice文件夹，选择Experiment New Experime

8、nt。当你想用原来保存的Exprement模板时，使用菜单栏而不是快捷键，你也可以按Ctrl-E。Experiment Templates对话框出现2、在对话框中，点击Practice标签，选择Simple Analysis template，点击键。Experiment Layout 对话框出现，显示试管标记、关键词、模板的设置等。3点击Experiment Layout对话框中的各种标签，查看设置，然后点击Cancle。这些设置是你建立模板时设定的，注意：这些数据是只读的，不能修改。4点击OK建立一个新的实验注意原先的实验已经关闭，一个新的实验Simple Analysis在浏览框中。当你

9、在做实验时，一次只能打开一个实验。注意global worksheet中包含有点图和Population Hierarchy，在点图中没有数据。Importing an Experiment接下来，你将在Practice文件夹中导入一个实验。导入实验与导入模板的不同之处在于它们包含有记录的数据。1、选择Practice文件夹，选择FileImportExpriments默认情况下，当导入一个实验时，D:BDExportExperiment folder将会出现，除非你以前改变路径导向到另一个文件夹。2、选择命名为Manual Comp的文件夹，点击Import。导入的实验都是以文件夹形式出现，

10、文件夹在导入后在浏览框中将会以实验Expriment出现。注意原先的实验没有关闭，新的实验加在Simple Analysis Experiment后面有三种方法在浏览框中增加实验：1、用浏览框工具栏中的快捷键来新建一个空的实验（默认条件设置）。2、ExprimentNew Expriment命令新建一个新的实验，实验来自于一个原来保存的模板，模版包含下列部分：点图、门、统计图和仪器设置。3、FileimportExpriment命令，可新建一个实验，通过这个方法获得的实验包括原来保存的实验条件等和数据。Working with Experiments in the Browser现在在浏览框中

11、有三个实验，一个关闭的实验 (Experiment_001), 一个打开的实验模板(Simple Analysis)和一个关闭的导入的实验 (Manual Comp)。接下来的练习来证明关闭和打开的实验之间的不同，以及如何来比较仪器设置。1、点击Manual Comp Experiment前面的（+），展开实验。尽管在browser框中显示出实验组分，但点图依旧是空白的，你必须打开一个实验来获得它的数据。注意：展开一个实验和双击打开一个实验是不同的2、双击Manual Comp Experiment来打开Simple Analysis Experiment关闭，在worksheet中显示Man

12、ual Comp Experiment中的分析目标。3、点击其中一个实验样本Manual Comp Experiment中，在每个样本下面含有多个试管，注意每个试管都是绿色的，说明每个试管都包含有数据。4、点击试管指示到任何一个试管。在global worksheet中包含有点图、试管中含有数据，数据就显示在worksheet中，可用试管指示来定位试管，则将显示所选择试管的数据。5、在browser中选择其它试管注意：数据并没有改变，必须依靠试管指示，才能在global worksheet中显示其他试管的数据。尝试把试管指示指向另一个试管，注意数据的变化。6、展开Simple Analysis

13、 Experiment，选择Instr Settings。注意Inspector上的仪器设置是所选Instru settings的设置，尽管实验已经关闭。7点击Instrumengt框中的各个参数Instrment框显示了试管指示所对应的试管的仪器设置（Manual Comp Experiment中的tube）。Inspector显示的是试管的设置或者是所选择的Instr Settings的设置。在这个例子里，Inspector显示的是Simple Analysis Experiment实验的仪器设置，你可以用Instrument框和Inspector来比较浏览器中的任何两个仪器设置。显示的是

14、Manual Comp_001中PE试管的仪器设置显示的是simple Analysis_001的instru Settings的仪器设置Using Gating Features在BD FACSDiva软件中：可以创建四种类型的门：polygon、rectangle、quadrant和interval。自动圈门工具Automatic和Snap-To门工具可用来设置polygon和interval门。在这一节中，你需要先前所建立的Simple Analysis 和Manual Comp 实验。Creating Gates这部分说明了在Manual Comp Experiment中怎么用work

15、sheet中的菜单栏来设不同的门：1、打开Manual Comp Experiment2、把试管指向对准Calibrite样本下的Pre Sort试管，如下图：3、在FSC vs SSC点图上建一个Autopolygon门选中worksheet菜单栏的（Autopolygon）工具。在点图中点击粒子，一个门将会自动地画成。4、试管指示指向下一个试管，可以看到一些粒子在门外。5、选择FSC vs SSC图的Autopolygon门，Delete按Delete键而不是Backspace键，如果Delete键不工作的话，右击门，选择delete。这将会激活Delete键，下次就可以使用。6、在FSC

16、 vs SSC点图上创建Snap-To polygon门Snap-To polygon和autopolygon门不同，Snap-To polygon门自动重新计算。可看见Snap-To polygon门的边框比较粗。7、把试管指示回到Pre Sort 试管，注意门的变化。8、（可选）用其它设门工具进行练习，在点图上去除Snap-To门，创建一个Rectangle门（）和一个Polygon门（）Editing Gates这部分描述怎样移动和改变门的大小1、选中FSC vs SSC点图上的门，在每个顶点上会出现一个把手。2、移动选中的门移动门的时候，选择门的边，而不是顶点，可看到门的标签随着门一起

17、移动3、拖动其中的一个把手来改变门的大小在你移动或者改变Snap-To门时，门将不会自动调准。你可以通过右击门的边，选择下拉菜单中的重新计算。4、通过拖动门内的标签，可把标签拖到门外5、在门外点击，释放门6、关闭Manual Comp Experiment.Subsetting PopulationsSimple Analysis Expriment 包括三个点图和一个Population Hierarchy。Population Hierarchy主要是用来查看各个门内群体关系。在这里，你需要原来创建的Simple Analysis Experiment，在软件安装时，样本文件存在于BDEx

18、portFCS文件中。导入数据在你进行分群前，需要含有数据的点图：1、通过双击来打开Simple Analysis Expriment，只有把实验打开时，你才能导入数据。2、选择FileImportFCSfiles通常，D:BDExportFCS文件出现，除非你原来改变过路径3、双击4色文件，在双击Calibrite beads文件夹来打开。4、选择文件中所有的FCS文件，点击Import当导入FCS文件时，需要选择文件，而不是文件夹，可以通过Shift和Ctrl键来选择多个甚至全部。这样就增加了一个新的样本Calibrite Beads，含有四个带数据的试管。5、在Calibrite bea

19、ds样本中，把试管指向Tube-0016、在浏览框中选择Tube-001，勾选Inspector中荧光参数前的Log Checkbox。7、对Calibrite Specimen实验的其它试管做相同的操作Defining and Subsetting Populations1、Tube-001的FSC vs SSC点图上，建立一个Autopolygon 门。新的P1群就在Population Hierarchy上出现。2、把标签P1拖出Autopolygon gate（点中P1标签，拖出门外）。3、建立一个只显示P1群的PE直方图右击直方图，选择show population P1。在直方图上

20、只显示P1群体，注意到直方图上所有的点都是红色的，是P1的颜色。4、PE直方图上，在PE阴性峰上创建一个Autointerval门（）Population Hierarchy图上P2群显示在P1群下面。当你在一个群下创建一个门，新的群体是原来群体的一个亚群。注意到P2旁边的颜色框是一个十字叉，说明子群的颜色仍旧是其母群的颜色。默认情况下，Interval和Quadrant门定义的群体一般不会被授予颜色。5、点击FITC vs PerCP-Cy5.5点图，显示P2群体在点图上右击，选择show population P2点图是空白的，因为P2群体没有颜色，下面是给P2群体设置一个颜色：1）双击P

21、opulation Hierarchy前的颜色框2）选择一个颜色6、在 FITC vs PerCP-Cy5.5点图上建一个FITC阳性的Rectangle门。扩展门的边越过X轴，可以包含有轴的粒子。因为点图显示的是P2的群体，新的P3群体是P2群体的一个子集。下面的步骤显示另一种建群体的方法。7、设置FITC vs PerCP-Cy5-5点图显示全部的粒子Tip 你也可以用Inspector来显示一个点图的群体层次结构。8、Population Hierarchy中选择P2群体，在PerCP-Cy5.5阳性群体上画一个Autopolygon门。结果如下，可以看出新创建的P4群体是P2群体的一个

22、子集。在进行分群时为了避免错误，保持Population Hierarchy可视。在你改变群体的名字或者颜色时，你还是可以选择群体。Gating Multicolor Experiments下面的教程说明了在用人外周血进行淋巴细胞亚群分析时，interval和quadrant门的特性。在这个实验中，细胞用CD3 FITC, CD16+CD56 PE, CD45 PerCP-Cy5.5, CD4 PE-Cy7, CD19 APC, 和CD8 APC-Cy7进行染色进行这一步学习，您需要6-color Experiment（BDExportExperiment folder）。1、在Practic

23、e folder.中，导入6-Color gating选择文件夹，选择File > Import > Experiments，在BDExportExperiment folder中定位6-color gating。选择文件，点击导入。2、双击实验，打开实验3、展开lymphocytes样本，试管指向定位在3/16+56/45/4/19/8试管，如下图。在worksheet点图中就会显示数据4、在CD45 vs SSC点图上，单核细胞和粒细胞上画一个Rectangle门。Tip：把门延伸过点图的轴，这样就包含在轴上的点。5、在Population Hierarchy中把门命名为MNE

24、s（monocytes、neutrophils、eosinophils），选择P1，输入MNEs，enter。6、在Population Hierarchy图中右击MNEs，选择 Invert Gate。在Population Hierarchy图上就增加了一个新的群体（不包含单核细胞、粒细胞和嗜曙红细胞）。7、右击FSC vs SSC点图，选择显示populationNoT（MNEs），结果如下图。8、在淋巴细胞上画一个Autopolygon gate ()，在Population Hierarchy上把这个群体命名为lymphocyte，结果如下图，淋巴细胞是NOT MNEs的一个子集。I

25、dentifying Lymphocyte Subsets下面就把淋巴细胞分为T、B和NK细胞。1、右击FSC vs SSC点图上的淋巴细胞门，选择 Drill down。一个新的FSC vs SSC图出现，只显示淋巴细胞。在一张点图上定义了一个门后，通过Drill down就可以创建一个只显示门内群体的点图。2、在新的点图上，把FSC换成CD3。3、在CD3+细胞上画一个Interval gate（一般应用在直方图上，在点图上也适用），命名新的群体叫做T细胞。4、用类似的方法可以得到B、NK亚群5、按住ctrl键，在Population Hierarchy中选择T、B和NK，右击，选择Joi

26、n Gates，在Population Hierarchy图上就出现一个新的群体，是T、B、NK细胞的总合。Calculating Compensation Using Instrument SetupBD FACSDiva软件可以自动的计算光谱的重叠值，在进行补偿时，更加节约时间，更加精确。下面介绍如何使用Instrument Setup feature。Setting Up Compensation Controls1、打开Experiment_0012、编辑参数如果计算机与仪器相连，打开Specimen-001，把试管指针指向Tube-001，在Instrument框中编辑参数。如果脱机

27、操作，选择Expriment下的instrument setting，在Inspector中编辑参数。3选择 Instrument-Instrument setup-Create compensation controls。下面的对话框将出现4增加或者删除对照，定义标记特异性对照，或者可以改变补偿控制的顺序。5点击OK6展开Compensation Control specimen来查看补偿对照。Creating an Instrument Configuration在Instrument Setup中，下一步就是记录数据。为了计算补偿，首先要把instrument configuration

28、设置成符合记录数据的格式。1选择 Instrument-Instrument Configuration2在Instrument Configuration对话框中，选择Add Configuration3在Instrument Configuration对话框中，输入2 laser, 4 color，点击OK注意：确认你输入的名字完全与图上的相符，如果字符的空格或者大小写与例子不符，在计算补偿时，就会有一个错误信息。4在instrument configurations列表中，选择2 laser，4 color，点击Add Parameter键6次instrument configurati

29、on图应该如下所示：5命名laser和detector，输入每个参数的名字首先应该确定一个Detector，再改变参数的名字。可以通过查看其他的configuration来找到每个参数合适的laser和detector。通过相应column的下拉菜单来选择所对应的设置，把参数的名字改为FSC、SSC、FITC、PE、PerCP和APC。6 点击okImporting Data and Calculating Compensation现在已经设置好与我们试验相符的confuguration，接下来就是导入数据。可以用原来记录的数据（Sample expriment）来计算补偿1选择 Practi

30、ce folder ，从BDExportexperiment folder里导入AutoComp Expriment。选择File- Import- Experiment，找到AutoComp Expriment 文件夹，点击Import。2双击AutoComp Experiment打开实验这个实验包含有一个Compesation Specimen和四个荧光参数的试管3双击Unstained Control Tube，打开对应的worksheet4 在FSC vs SSC点图上，移动P1门包含所有的阴性粒子5右击门的边框，选择Apply to All Compensation Control。

31、6 双击第一个Stained Control Tube（FITC Stained Control），在worksheet打开相应的点图。7确定P2门包含了所有的阳性颗粒。P2门是一个Snap-To Interval 门，已经包含了所有的阳性颗粒。如果一些颗粒在门外，右击门，选择recalculate。8双击下一个Stained control tube，打开相应的worksheet。9对下面的试管，重复7和8，当所有的门设定好后，你可以进行补偿计算了。10选择Instrument-Instrument setup-Calculate Compesation。 将会出现一个对话框，可以进行命名。

32、11 对于新的补偿进行命名，点击ok。一个新的设定，包括了参数和标记信息，阈值和电压，计算好的补偿。新的仪器设置储存在Setup catalog下。Calculating Compensation Manually在进行下面实验时，需要导入Manual Comp Experiment，进行手动补偿时不需要链接仪器。Adjusting FITC Compensation这部分描述了怎样计算FITC荧光的溢出，其他荧光也是类似的。1选中Compensation Controls Specimen样本下的FITC Stained Control管。2 在FSC vs SSC点图上创建一个Snap-T

33、o gate，如下图3在worksheet上选择FSC vs SSC点图，右击点图，选择Show Populations > P1。4在FITC-A vs PE-A点图上，画一个FITC阳性的Interval gate。在Population Hierarchy view图上，进行重命名为FITC Positive。5在Population Hierarchy view图上右击FITC Positive，选择Invert Gate，重命名为NOT (FITC Positive) population Negative，如下图6 在Inspector框中显示补偿管，确定Enable Com

34、pensation checkbox 已经被选择。7调节PE-%FITC荧光补偿，直到，FITC阳性群体的荧光平均值与阴性对照的相同，如下图。8用同样的方法调节PerCP-CY5-5-%FITC、APC%FITC的荧光补偿，结果如下图。其他荧光通道可用相同的方法进行调节。Manually Constructing a Compensation Matrix进行补偿完毕后，可以拷贝这些设置来进行实验。1放大Inspetor框，这样就可以看到整个补偿网络。2在Browser框中，右击FITC Stained Control管，选择Copy Spectral Overlap。3展开Calibrite

35、 Specimen，可以看到五个试管。4选择Calibrite Specimen下的5个管子，右击试管，选择Paste Spectral Overlap。在数据拷贝后，在浏览器中选择其中一个Calibrite Tube。在Inspector框中，可以看到FITC的补偿网络。如下图5轮流拷贝其它的Spectral Overlap settings，粘贴到这五个试管。当完成后，结果应该如下图在进行补偿之后，就可以用相应的条件进行样本检测Tip：可以进行导出和导入的模版：Expriment、Template、Panel Template、Analysis Template、Settings、FCS

36、Files。Exporting Experiments1 在浏览框中选择experiments2 选择 File > Export > Experiments.3 在Export Experiments对话框中，进行合适的选择，点击OK。Importing Experiments1 选择File > Import > Experiments.2 在对话框中选择实验文件夹或者Zip文件夹。3 选择需要的文件，点击Import。Exporting Experiments as Templates1右击experiment，choose Export > Experim

37、ent Template，Export Wizard dialog出现。2输入template type和模板名字（模版名字是进行区别的唯一标志），点击next3下面是一些可选项进行选择后，点击Finish。Import a Template根据已经储存的模板来建立一个实验（不能用快捷键）choose Experiment >New Experiment or press Ctrl-E. 出现Experiment Templates dialog，进行选择你所需的模板，最多可建立50个拷贝（实验拷贝）。Exporting a Specimen as a Panel Template1Ri

38、ght-click the specimen、choose Export > Panel Template，Export Wizard dialog出现。2选择你panel所需要的global worksheet，点击next。3选择template type，输入名字，点击next。4下面是一些可选项，点击Finish。Importing a Panel Template选择Experiment > New Specimen or press Ctrl-M，Panel Templates dialog出现，选择方式与导入模板类似。进行选择，最多50个拷贝（样本拷贝）利用Panel

39、 Template（包含有实验的仪器设置，分析方式）可对其他样本进行分析，但是样本中所包含的试管数必须同。右击specimen，选择Apply Panel Analysis，出现Panel Template dialog对话框，进行选择，点击OK。Exporting a Analysis Template1 Right-click an Analysis icon（）, 或者含有 的tube或者global worksheet， choose Export > Analysis template。Export Wizard dialog出现。2选择template type，确定名字，点

40、击next。3下面是可选项，点击ok。Creating a Tube with a Predefined Analysis Template1Choose Experiment > New Tube or press Ctrl-T。2Analysis Templates dialog出现，进行选择，点击OK。最多进行50个拷贝（Tube数）。Creating Specimen- or Tube-Specific Settings1 右击浏览框Cytometer Settings图标()，选择Export to the Instrument folder。2 输入文件名称，点击Export.3 默认情况下文件会储存在D:BDExportInstrument中。Importing Settings1 在浏