淮安食管鳞癌与癌旁组织中差异表达microRNAs的初步分析

1、淮安食管鳞癌与癌旁组织中差异表达microRNAs的初步分析    0 引言MicroRNAs(miRNAs)是一个长度为2l-25 个核苷酸非编码的小RNA 大家族，由具有发夹结构的7090 个碱基大小的单链pre-miRNA 经过酶切加工后生成，人类基因组编码了超过1000 个miRNA。有关miRNA 的研究分析提示，miRNA 参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育、造血、器官形成、凋亡、细胞增殖，甚至肿瘤发生1。近几年，恶性肿瘤中的miRNA 表达异常越来越受到重视，现有研究表明miRNA 与肿瘤发生密切相关2。因此，了解miRNA 在正常组

2、织与肿瘤组织中的差异表达，有助于明确人类肿瘤相关的miRNAs，从而进一步研究其在肿瘤中的作用机制。由于高通量的微阵列技术的发展，使得miRNA 基因组的研究日益深入。高通量微阵列技术由于具有联合检测，检测效率和灵敏度高，操作过程简化，样本需求量小等优势而被广泛应用。国内外学者运用miRNA 微阵列研究发现了多种肿瘤存在miRNA 的异常表达或缺失。食管癌是人类常见的消化道恶性肿瘤，我国是食管癌高发地区之一，每年约有24 万新诊断的食管癌病例，约占全世界食管癌病例数的一半3。淮安是我国食管癌高发地区之一，其发病率和死亡率居高不下。目前食管癌临床治疗手段还很有限，预后较差，因此对食管癌高危险人群

3、进行早期筛检和干预是降低食管癌发病率和死亡率，改善患者生存质量的有效手段。本研究旨在应用高通量的miRNAs 分析平台，用人microRNA 寡核苷酸基因芯片在淮安地区食管鳞癌患者癌组织与癌旁组织中初步筛选差异表达的miRNAs，希望能发现食管癌中特异表达的miRNAs 作为食管癌早期筛检和诊断的标志，为进一步研究其在食管癌发病机制中的作用奠定基础。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 食管癌患者志愿者招募本研究志愿者来自江苏淮安市第一人民医院。食管癌患者入选标准：经病理或内窥镜诊断明确的原发性食管癌患者，未经放、化疗治疗，在淮安当地居住20 年以上的汉族居民。1.1.2 个人资料经患者知情同

4、意，本次研究选取了3 名志愿者的食管癌和癌旁组织。3 位患者均为男性，年龄分别为61 岁，71 岁，62 岁。全部病例经过病理确诊为初发食管中段鳞癌患者，未发现远处器官转移，术前未施行任何治疗。1.1.3 样本采集及保存消化外科手术切除癌原发灶后，迅速切取癌组织及距离癌组织5cm 以上的远端癌旁组织标本。将组织块剪至约0.5×0.5×0.5cm3 大小，用生理盐水冲洗后迅速置于液氮中保存。1.1.4 主要仪器和试剂试验中所用仪器主要包括2100 Bioanalyzer(Agilent)，Hybridization Chamber(Agilent)，Hybridization

5、 Chamber gasket slides(Agilent)，Hybridization oven(Agilent)和Hybridization ovenrotator(Agilent) ，Microarray Scanner(Agilent) 。主要试剂为mirVana RNA Isolation Kit（Ambion），miRNA Complete Labeling and Hyb Kit（Agilent），Gene Expression Wash BufferKit（Agilent）等。1.1.5 miRNA 芯片分析micoRNA 微阵列基因芯片和质控探针由美国Agilent 公司提

6、供， 采用AgilentTMmicroRNA 微阵列芯片技术平台，其miRNA 探针序列信息来自于Sanger miRBaseRelease 13.0 版本数据库，涵盖了该数据库中866 个人类相关miRNA 探针。每张芯片都设计了与实验样品无同源性的核酸序列作为质控RNA，用于芯片合成、样品标记以及杂交实验的质量控制。芯片含有9 个阳性参照，6 个阴性参照，组织内源的5S rRNA 作为miRNA 芯片杂交的内源阳性对照。阴性对照包括空白对照和与实验样品无同源性的核酸序列探针。2 结果2.1 总 RNA 提取质量分析3 对样品总RNA 电泳结果显示，各样本的RNA 在18s 和28s 均可见

7、明显的峰值，对分离纯化获得的RNA 进行吸光度(A)值测定，3 例食管癌患者的癌组织和癌旁组织样本浓度跨度为0.195-0.646(g/l)，A260/A280 基本在2.00 左右，表明RNA 总量及质量符合miRNA 微阵列的检测要求。2.2 杂交数据的分布特征将 3 对食管癌组织和癌旁组织的芯片杂交的原始数据经过均一化和对数转换以后绘制成Box-Whisker plot 箱线图，用以评估芯片杂交数据的分布和分散程度。由可见，各芯片的杂交数据经变换后数据基本对称，符合正态分布的特征。2.3 microRNA 的差异表达分析对 3 对食管癌组织和癌旁组织进行差异表达的microRNA 分析，

8、筛选出差异表达在2 倍以上的microRNA 共15 个，其中在癌组织中表达上调的有7 个，分别为hsa-miR-20a，hsa-miR-155，hsa-miR-574-5p，hsa-miR-21*，hsa-miR-183，hsa-miR-601，hsa-miR-623；表达下调的有8 个，分别为hsa-miR-186，hsa-miR-10a，hsa-miR-144，hsa-miR-338-3p，hsa-miR-192，hsa-miR-218，hsa-miR-451，hsa-miR-139-5p。3 讨论随着分子生物学理论的发展和分子检测技术的突破，非编码RNA（non-coding RNA）

9、，特别是miRNA 已成为近年来的研究热点。miRNA 是调节基因表达、调节生长发育和维持机体正常生理功能的一类重要小分子RNA，广泛存在于哺乳动物细胞内，具有强大的调控基因表达的作用，主要通过降解靶mRNA 和抑制靶mRNA 的翻译两种作用方式调控基因的表达。近年来，针对miRNA 与肿瘤的关系已开展了大量的研究。研究发现，肿瘤细胞与正常组织来源细胞间miRNA 表达谱具有明显差异，且多数miRNA 基因位于与肿瘤形成相关性脆弱基因位点，提示miRNA 在肿瘤形成过程中可能扮演着重要的角色4。Lu5等发明了一种具有高度特异性磁珠流式细胞技术，系统地分析了334 种淋巴瘤和实体瘤中miRNA

10、的表达谱，并首次认为miRNA 水平可用于肿瘤的诊断和分期。Mitchell6等用qRT-PCR 技术在前列腺癌患者血清中检测到miR-141，进一步证明了miRNA 可作为肿瘤诊断的循环系统分子标志，增加了miRNA 表达谱作为临床诊断指标的可能性。因此，识别特异性肿瘤相关miRNAs 已成为肿瘤早期发现和诊断性生物标志研究的一个新的研究热点。现有实验和临床研究证据显示，miRNA 可以作为一类新的肿瘤原癌基因或者肿瘤抑癌基因，通过促进或抑制肿瘤原癌基因或抑癌基因的表达，从而调控肿瘤细胞的增殖和凋亡。如有研究发现，miR-17-92 作为原癌miRNA，参与了包括恶性淋巴瘤在内的多种肿瘤的发

11、生发展过程7。此外，多项研究表明，在线虫中最早发现的miRNA 之一的Let-7 在哺乳动物中负性调控多种癌基因和细胞周期调节因子，可能是一个肿瘤抑制基因8，其低表达与人类多种肿瘤尤其是肺癌的发生发展有关。Iorio 等9发现mir-10b、mir-125b、mir-145、mir-21和mir-155 等在乳腺肿瘤和正常组织中的表达存在差异，而且miRNA 表达水平与雌激素受体水平、孕激素受体水平、淋巴结转移、增殖指数、Cerb-B2 和p53 表达水平等密切相关。Cimmino 等10发现B 细胞慢性淋巴细胞白血病与mir-15a 和mir-16-1 关系密切，它们可能通过转录后抑制Bcl

12、-2 表达，从而表现抑制肿瘤生成的作用。Muakami 等11对肝癌组织和癌旁正常组织的miRNAs 表达谱进行分析时，发现癌组织中mir-18、pre-mir-18 和mir-224 比正常组织表达显著升高，miR-199a3、 miR-195、 miR-199a、 miR-200a、miR-125a 较正常组织表达降低，指出对这些miRNAs 的检测可能有助于肝癌的分型和早期诊断。以上相关研究都表明miRNAs 的差异性表达普遍存在于不同类型的肿瘤中，而且表达水平的变化与机体的激素水平、癌基因和抑癌基因的表达水平、肿瘤的类型和病程等因素密切相关。这些miRNAs与不同肿瘤的关联提示其可能成

13、为肿瘤早期发现和早期诊断的候选生物标志。尽管大量研究证实特定miRNA 在细胞生长、分化和凋亡等活动中起着重要的调控作用，但是应用单一的miRNA 指标进行特定肿瘤的筛检和诊断很难保证较高的灵敏度和特异性。关于多种人类癌症的系统性研究表明，特定miRNA 表达谱可以反映肿瘤的发育起源和分化特征。因此，识别肿瘤特异miRNA 表达谱用于肿瘤的早期发现和诊断有助于提高肿瘤生物标志的特异性和灵敏度。本研究在3 对食管癌组织和癌旁组织中共筛选出15 个差异表达miRNAs，在癌组织中表达上调的有7 个（hsa-miR-20a， hsa-miR-155，hsa-miR-574-5p，hsa-miR-21

14、*，hsa-miR-183，hsa-miR-601，hsa-miR-623），表达下调的有8 个（分别为hsa-miR-186，hsa-miR-10a，hsa-miR-144，hsa-miR-338-3p，hsa-miR-192，hsa-miR-218，hsa-miR-451，hsa-miR-139-5p）。其中，miR-21 在结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、 乳腺癌等多种实体肿瘤中表达上调，提示其对肿瘤的作用可能具有普遍性12。此外，有研究报道miR-155 与乳腺癌的发病风险密切相关，通过调控癌基因CerbB-2 的表达进而影响肿瘤的发生13。魏任雄14等发现miR-144 在骨肉

15、瘤中表达水平显著下调。部分食管癌相关miRNAs 的研究也识别了一些癌组织和癌旁组织中差异表达显著的miRNA，如miR-103、miR-107、miR-25、miR-130b、miR-194、miR-192、miR-21、miR-203、miR-20515等。这些研究表明同一miRNAs 可参与多种肿瘤的发生发展，而特定类型肿瘤的发生涉及多种miRNA 的调控异常。因此，研究食管癌特异的miRNAs 表达谱对于疾病筛检和肿瘤形成的机制研究具有重要价值。目前，我们正在大规模人群中采用实时定量PCR 等方法对此次筛选出的差异表达miRNA 进行验证性研究，并通过进一步分析初筛的差异表达miRNA

16、s 在食管癌发生中的作用，识别影响食管癌发病的关键miRNAs 及其调控机制，以期构建食管癌特异的miRNAs 指标体系用于食管癌的高危人群筛检和早期诊断。中国医学论文网专业提供医学论文发表服务，并提供大量临床医学毕业论文，如有业务需求请咨询网站客服人员！参考文献 (References)1 Zhang B, Pan X, Anderson T A. MicroRNA: a new player in stem cellsJ. Journal of cellular physiology, 2006,209(2): 266-269.2. Shenouda S K, Alahari S K. M

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