表皮生长因子受体单克隆抗体抗肺癌作用的研究

1、    表皮生长因子受体单克隆抗体抗肺癌作用的研究        摘要：目的实验观察表皮生长因子受体单克隆抗体(EGFR McAb)egf/r3对肺癌的治疗作用。方法体外细胞增殖抑制实验采用MTT法，裸鼠体内移植瘤采用同时治疗(T1组)与延后治疗(T2组)两种方案。结果egf/r3 McAb对高表达EGFR的SPC-A1和A549肺癌细胞体外均具有增殖抑制作用，并呈剂量依赖性；以SPC-A1进行裸鼠皮下移植做体内实验，至治疗结束，T1组50 %成瘤(3/6)，对照组100 %

2、成瘤(6/6)；至实验结束，T1组与T2组瘤体抑制率分别为75 %与67 %，瘤重抑制率分别为65 %与47 %。病理切片显示治疗组肿瘤组织局部坏死，电镜示线粒体凝缩、嵴断裂、溶解。结论egf/r3 McAb部分抑制肺癌细胞成瘤，明显延缓已成瘤肺癌生长，具有一定的抗肺癌作用。其体内抗瘤效果强于体外，可能与宿主免疫系统参与瘤细胞溶解有关。关键词：肺肿瘤；表皮生长因子受体；单克隆抗体；免疫治疗中分类号：R73-362文献标识码：A文章编号：1000-7431(2000)01-0035-03EFFICACY OF EPIDERMAL GROWTH FACTORRECEPTOR ANTIBODY AG

3、AINST LUNG CANCER IN VITRO AND IN NUDE MICEREN Xin-ling（Department of Respiratory Disease,Xijing Hosptial,Fourth Military Medical University,Xian 710032,China）SHEN Li-ying（Department of Respiratory Disease,Xijing Hosptial,Fourth Military Medical University,Xian 710032,China）JIN Bo-quan（Department of

4、 Respiratory Disease,Xijing Hosptial,Fourth Military Medical University,Xian 710032,China）Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of epidermal growth factor receptor (EGFR) monoclonal antibody (McAb egf/r3) against lung cancer.MethodsInhibition of cell growth in vitro was observed by MTT assay.

5、The effect of antibody on growth of tumor xenografts in nude mice was investigated with group T1 treating at the time of tumor inoculation and group T2 treating of established tumors. ResultsThe egf/r3 McAb inhibited the cell growth dose-dependently on both lung cancer cell lines SPC-A1 and A549.At

6、the end of treatment 50 %(3/6) sites in group T1 were tumor free,while 100 %(6/6) sites in control group had tumor forming. At the end of experiment,the inhibition rates of tumor size and of tumor weight in group T1 were 75 % and 65 % respectively, and in group T2 were 67 % and 47 % respectively. Pa

7、thologic examination showed that the treated tumor was necrosed.Under electronic microscope,the mitochondria appeared condensed and its creases disappeared.ConclusionThese results suggested that the antibody could partly inhibit lung cancer formation, retard the growth of cancer cells. The antibody

8、was found to have substantially a better antitumor activity in vivo than that in vitro,it is perhaps due to the supplementary host immune functions by the IgG2a McAb.Key words：Lung cancerEpidermal growth factor receptorMonoclonal antibodyImmunotherapy肺癌细胞的无限增殖是一个复杂的生物学过程，其机理尚未完全阐明。近年来，有关表皮生长因子受体(epi

9、dermal growth factor receptor,EGFR)研究工作主要在乳腺癌、卵巢癌、阴道上皮癌以及头颈部肿瘤等恶性组织中进行，结果表明EGFR的过度表达与某些肿瘤的发生和预后不良有关1，国外应用EGFR单克隆抗体(EGFR McAb)开展的肿瘤实验性治疗也多是在上述肿瘤中进行。肺癌存在EGFR的过度表达，但是就EGFR与肺癌的发生、发展、预后以及组织特异性的关系等诸多方面尚未达成共识2，尤其是针对EGFR的肺癌治疗研究报道甚少。作者曾应用流式细胞仪分析肺癌细胞株EGFR的表达，结果发现肺癌细胞系存在EGFR的表达，并可能存在着生长因子自分泌环，提示EGFR及其配体在肺癌的发生发

10、展中可能发挥了重要的调控作用。为此，作者应用egf/r3 McAb进一步开展了体外及裸鼠体内抗肺癌作用的实验研究，为探索肺癌分子免疫治疗的新途径积累资料。材料和方法一、肺癌细胞系、实验动物及主要试剂肺腺癌细胞系A549和SPC-A1分别引自第四军医大学口腔医学院和生物技术中心，肺巨细胞癌细胞系PLA-801引自北京解放军301医院病理科3。BALB/c(nu/nu)裸鼠由第四军医大学动物中心提供。EGFR McAb egf/r3由古巴分子免疫中心提供，IG2 McAb(腹水)由第四军医大学免疫学教研室提供，RPMI 1640培养基购自美国GIBCO公司，四唑盐(MTT)购自美国SIGMA公司，

11、胎牛血清(FCS)由中国浙江金华生物制品公司生产。二、体外细胞增殖抑制实验采用MTT法4。取对数生长期的SPC-A1和A549细胞，制成单细胞悬液，活细胞计数98 %，以2×103/孔接种于96孔板，用1% FCS RPMI 1640培养基培养，细胞贴壁后加入不同浓度的egf/r3 McAb，继续培养4天，在570 nm波长测各孔吸光值A。按下列公式计算抑制率：结果以每组5孔的均数±标准差(±s)表示。三、egf/r3 McAb裸鼠体内抗瘤实验选择BALB/c(nu/nu)68周龄裸小鼠24只(平均体重18.6 g±1.7 g)，雌雄兼用。取对数生长期S

12、PC-A1细胞，制成单细胞悬液，按7×106/只，将细胞接种于裸鼠侧腹部皮下血供丰富的部位，按随机分组设计将动物分成4组，分组及给药方法见表1。对照组，同时治疗组，无关抗体组裸鼠于接种24 h后开始治疗，延后治疗组于第6天移植瘤体积直径约0.5 cm时开始治疗。肉眼观察出瘤情况，第6天开始用游标卡尺测量肿瘤长径(a)，短径(b)，每3天测量1次，至实验结束。表1动物分组及给药方法分组动物数量药物给药途径药量(/次/只)总药量给药方法对照组6PBSIP0.2 ml1.8 ml1次/日同时治疗组6egf/r3IP1 mg(0.2 ml)9 mg1次/日延后治疗组6egf/r3IP1 mg

13、(0.2 ml)4 mg2次/周无关抗体组6IG2IP0.2 ml1.8 ml1次/日肿瘤完全抑制作为0，按下列公式计算肿瘤体积和瘤体抑制率： 至第21天对照组动物瘤体直径约0.8 cm1.0 cm，动物开始死亡时结束实验，处死动物，摘除移植瘤称重，按下列公式计算瘤重抑制率：四、肿瘤病理形态学观察摘除移植瘤，常规HE染色，做病理检查。体外实验收集经100 g/ml egf/r3 McAb处理48 h的SPC-A1细胞，以PBS处理的做对照，反复洗涤、离心、加入1% 戊二醛固定12 h以上，然后将细胞团块切成细条状，PBS轻洗涤，1% 锇酸固定60 min，取出后浸入PBS 30 min，取出行

14、丙酮梯度脱水、包埋、聚合、制成超薄切片，透射电镜观察并照相。五、统计学处理数据采用均数±标准差(±s)，组间比较采用团体t检验。结果一、egf/r3 McAb对人肺癌细胞系增殖的影响用不同剂量的egf/r3 McAb处理3株肺癌细胞系，均可见一定程度的增殖抑制，McAb浓度在0.001 g/ml时这种抑制作用即出现，并随抗体浓度增高而增加，在500 g/ml时，抑制率均达到35%左右，呈剂量依赖性(见1)，经egf/r3 McAb处理的肺癌细胞死亡较少。1egf/r3 McAb对培养肺癌细胞增殖的影响二、egf/r3 McAb对裸鼠体内移植瘤的治疗作用本实验对照组、无关抗体

15、治疗组及延后治疗组裸鼠全部出瘤。同时治疗组3只动物分别于皮下移植SPC-A1细胞后第5、6、7天瘤块消失，第9天治疗结束，一半(3/6)部位未触及瘤组织块，成瘤率为50 % ，另3只动物肿瘤体积明显小于对照组(见表2)，第21天实验结束，同时治疗组1只动物始终未见肿瘤生长，解剖局部未见残余肿瘤组织。与对照组相比，同时治疗组肿瘤生长缓慢，尤其以治疗期间最明显，第6天瘤体抑制率达到85%，第21天，瘤体抑制率仍然达到75 %，瘤重抑制率为67 %。延后治疗组，与对照组相比，肿瘤生长缓慢，第21天瘤体抑制率为65 %，瘤重抑制率为47 %。表2egf/r3对裸鼠SPC-A1移植瘤形成的抑制作用动物数

16、肿瘤形成肿瘤形成率肿瘤体积(cm3)*对照组666/60.50±0.22同时治疗组633/60.06±0.10*延后治疗组666/60.32±0.08*无关抗体组666/60.44±0.18*P0.01，与对照组相比，为接种肿瘤后第9天测量。 三、肿瘤形态学变化对照组移植瘤体积较大，表面粗糙，可见多个结节，同时治疗组与延后治疗组肿瘤体积小，瘤表面光滑，部分肿瘤可见中央坏死，无多结节现象。常规HE染色显示，两治疗组部分肿瘤组织结构疏松，呈局灶性坏死改变，以同时治疗组变化更明显。体外培养的SPC-A1，透射电镜检查发现胞浆内线粒体明显增多、凝缩、嵴溶解、胞浆

17、溶酶体增多。讨论目前，对肺癌采取的综合治疗措施的疗效远不能令人满意。因此，寻找新方法、探索新途径就成为当务之急。随着分子生物学及免疫学的发展，促使人们从分子免疫水平对肿瘤的发病机理、生物学行为等方面进行深入研究。近20年的研究发现信号转导的异常与肿瘤发生、发展有密切关系，其中酪氨酸激酶途径尤为人们重视。表皮生长因子受体具有酪氨酸蛋白激酶活性，其介导的信号途径在细胞生长与分化中有重要作用。研究表明EGFR在人类许多上皮源性恶性肿瘤组织表达增强，人肺癌尤其是NSCLC有过表达现象。过度表达的EGFR不断将表皮生长因子的刺激导入细胞内，引起细胞持续分裂增殖，最终导致肿瘤发生。肿瘤组织EGFR在发病早

18、期即出现高表达，且具有全程表达、特异性强、突变少、相对稳定等特点，因此有望成为肿瘤细胞新的表面标志物。考虑到EGFR在肺癌表达的特点及其介导的自分泌环(autocrine loop)在肺癌发生发展中的调控作用，针对EGFR进行肺癌分子免疫治疗成为可能。EGFR McAb能特异性地识别EGFR，阻断其介导的信号转导，打断自分泌环路，从而抑制肿瘤生长。本实验所用3株肺癌细胞系均存在EGFR的表达5及生长因子自分泌环。体外实验表明egf/r3 McAb对3株肺癌细胞系均有轻度增殖抑制作用并呈剂量依赖性。体外EGFR McAb对肿瘤细胞主要表现为抑制性而非毒性，与文献报告一致5。值得注意的是，尽管3株

19、肺癌细胞系EGFR的表达存在明显差异(SPC-A1、A549高表达，PLA-801低表达)6，但egf/r3 McAb对它们却表现出相似的抑制作用，提示虽然PLA-801 EGFR表达低，但其介导的自分泌环可能仍然在PLA-810细胞增殖中发挥了重要的调控作用。体内实验时，该抗体部分抑制肺癌细胞成瘤，明显延缓已成瘤肺癌细胞的增殖速度，显示egf/r3 McAb对肺癌的明显治疗效果，尤其是延后治疗方式更符合临床发病情况，此实验结果对今后开展临床工作更具有实用价值。对egf/r3 McAb体内外抗瘤效果进行比较发现，在体外主要表现为抑制性的，在体内却表现出杀伤性(瘤细胞坏死)，抗瘤效果明显优于体外

20、，提示egf/r3单抗在体内可能激活了宿主免疫系统参与抗瘤作用，这可能与egf/r3 McAb为IgG2a亚类有关7,8。基金项目：本课题部分为中国-古巴协作项目基金资助作者简介：任新玲，女，医学硕士，主治医师，讲师。作者单位：任新玲（第四军医大学西京医院呼吸内科，西安，710032）沈丽英（第四军医大学西京医院呼吸内科，西安，710032）戚好文（第四军医大学西京医院呼吸内科，西安，710032）金伯泉（第四军医大学免疫学教研室）马进（第四军医大学空医系）参考文献：1Baselga J,Menclelsohn J.The epidermal growth factor receptor as a target for therapy in breast carcinomaJ.Br Cancer Res Treat,1994,29(1):1272Rusch V,Baselga J,Cordon-Cardo C, et al. Differential expression of the epidermal growth factor receptor and its ligands in primary non-small