Losartan对血管平滑肌细胞增殖和血小板衍化生长因子及c-myc基因表达的影响

1、    Losartan对血管平滑肌细胞增殖和血小板 衍化生长因子及c-myc基因表达的影响        【摘要】目的探讨血管紧张素受体拮抗剂-Losartan治疗高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病的细胞作用机制。方法运用免疫荧光组织化学技术和激光共聚焦显微镜定量观察Losartan作用下的血管平滑肌细胞（VSMC）中细胞核增殖抗原（PCNA）、PDGF和c-myc原癌基因表达的平均荧光值。定量研究Losartan对体外培养血管平滑肌细胞增殖及血小板生长因子（PDG

2、F）和c-myc癌基因表达变化的影响。结果Losartan作用下，VSMC中的PCNA、和c-myc癌基因的平均荧光值均低于对照组，而PDGF的平均荧光值与对照组相比无显著差异。结论Losartan抑制VSMC的增殖及c-myc原癌基因的表达。该作用与癌基因调控的蛋白产物作用机制有关，是Losartan治疗高血压，参与血管重塑的重要的机制。【关键词】平滑肌细胞增殖Losartan Effect of Losartan on the proliferation of vascular smooth muscle cell and expression of PDGF and c-myc onco

3、geneCHEN Minsheng，LIU Jiankang，HUANG Shaohua.Department of Internal Medicine,Second Affiliated Hospital ,Guangzhou Medical College.【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism of Losartan in treating hypertension and atherosclerosis.MethodsThe immunofluorescent quantitative skill and laser scanni

4、ng confocal microscope (ACAS570) were employed to detect changes of the expression of PCNA, PDGF and c-myc in cultured vascular smooth muscle cell effected through the Losartan .ResultsUnder the observation of laser scanning confocal microscope (ACAS570), the fluorescent means of PCNA and c-myc expr

5、ession of VSMC in Losatan group were decreased compared with the control group， but that of PDGF had no changes.ConclusionLosartan possesses inhibitive effects on the proliferation of VSMC and the expression of c-myc oncogene.This effect deals with the molecular mechanism of oncogene regulation.【Key

6、 Words】Smooth muscle cellProliferationLosartan高血压病是一种以血管平滑肌细胞(VSMC)异常增殖为主要病变的疾病，导致VSMC异常增殖的某些致病因素（包括遗传因素和环境因素和遗传以及这两者之间的相互作用）都与调控细胞增殖的癌基因有关1。洛沙坦(Losartan)是临床上第一个用于高血压治疗的非肽类血管紧张素II受体拮抗剂，其药理及临床研究表明，Losartan通过特异性地拮抗Ang II受体I亚型舒张血管从而获得了良好的降压效果2。但它的降压作用是否与抑制VSMC增殖、参与血管壁结构的重塑有关，还有待证实。本实验中，我们观察了Losartan对体外

7、培养VSMC增殖的作用，同时探讨Losartan对PDGF、c-myc癌基因表达的影响，旨在证明Losartan的降压作用与调控VSMC增殖的癌基因表达之间的联系，并探讨该药的降压机制。材料和方法一、血管平滑肌细胞的体外培养组织贴块法培养血管平滑肌细胞7。无菌条件下分离SD大鼠的胸主动脉，剪碎后加入适量含10%胎牛血清的DMEM(Gibco公司产品)培养液，37、5%CO2培养箱中静置培养。用光镜和免疫化学方法进行鉴定。细胞传代后选择生长良好的第67代VSMC用于实验。二、实验分组及Losartan条件培养液的配制实验分为对照组和Losartan组。实验组加入Losartan条件培养液，对照组

8、为无血清DMEM培养液。Losartan (Merck 公司产品)条件培养液以无血清的DMEM培养液配制，终浓度为10-5g/L。三、Losartan对VSMC增殖能力和PDGF和c-myc原癌基因表达的影响选择第六代生长良好的平滑肌细胞，消化传代至96孔培养板上，传代细胞密度为5.0×107/L。细胞经18小时的预培养和6小时的预处理后，将Losartan条件培养液和无血清DMEM培养液加入实验组和对照组，37、5% CO2继续培养24小时。吸去培养液，pH 7.3的PBS洗3次，3%多聚甲醛固定30分钟，PBS洗3次。已固定样品按常规免疫组织化学方法处理。首先，5%正常山羊血清封

9、闭，室温孵育30分钟；倾去血清，滴加稀释度为150鼠抗大鼠细胞核增殖抗原(PCNA)、PDGF和c-myc的单克隆抗体(美国Santa Cruz公司产品)，4冰箱过夜。样品倾去抗体孵育液，PBS洗3次，换加110 FITC荧光标记兔抗鼠抗体(天象人公司产品)，室温孵育40分钟后，PBS充分洗板，每待测样品加入20l PBS后，分别置带电脑激光扫描共焦显微细胞仪(ACAS575UVC型，美国MERIDIAN公司)下,选用40×物镜,7%滤光片,确定激发光波长为488 nm,进入Kinetics-Image Scan程序,预扫描后选定最佳参数,对选定视野扫描并存储所获信息。扫描用于统计学

10、处理细胞总数在200个以上。四、结果分析进入Kinetics-Image Analysis程序，调出各次实验存储信息，分析并作综合处理并自动得出统计学结果，结果均以±s表示。结果一、血管平滑肌细胞鉴定倒置显微镜下，细胞生长呈典型的“谷与峰”结构特征，a-actin单克隆抗体免疫细胞化学显示95%为阳性VSMC。二、Losartan对VSMC增殖能力和PDGF、c-myc原癌基因表达的影响将免疫荧光显示技术和带电脑激光扫描共焦显微细胞仪的检测技术结合起来可较为准确地定量细胞中核酸和蛋白质的变化，样品中被检测物质的多少是以其检测物质被荧光标记的平均荧光值来表示，见表1。与对照组相比，Lo

11、sartan组中PCNA和c-myc的平均荧光值均低于对照组，有显著性差异(P<0.05)，而PDGF的平均荧光值与对照组相比则无明显差异(P>0.05)。表1两组各指标的荧光值(±s) 组别PCNAPDGFc-myc Losartan1338.56±232.71*828.69±127.54*1528.03±152.14*对照1542.71±200.04815.28±116.481620.26±174.58与对照组比，* P<0.05;* P>0.05讨论高血压病的最基本的病理改变是VSMC增殖，并向

12、内膜下迁移，以至血管腔增厚狭窄，外周阻力增高。许多促VSMC增殖的生物活性物质或致病因素，可通过促细胞增殖效应而引起高血压。其中癌基因的过度表达或抑癌基因表达不足都可能成为高血压发病的重要原因。因此，寻找抑制或调控VSMC增殖的药物就成为高血压防治中的重要环节。近年来发现Losartan降压的同时，有逆转心肌细胞增生肥大的作用3，这些与抑制VSMC增殖似有关联。因此，探讨Losartan对VSMC增殖的作用以及VSMC增殖所涉及癌基因的表达，有助于阐明Losartan的降压作用机制。我们运用免疫荧光显示技术和带电脑激光扫描共聚焦显微细胞仪的检测技术，两者结合起来可较为准确的定量细胞中核酸和蛋白

13、质的变化，该方法是90年代初发展起来的一种细胞检测技术，对单个细胞中核酸和蛋白质的变化可进行动态检测，方法简单，检测结果可靠。本实验Losartan组中， VSMC中PCNA和c-myc癌基因的表达比对照组有所降低(P<0.05)，说明Losartan对VSMC的增殖有明显的抑制作用。PCNA是细胞核中DNA聚合酶的附属蛋白，其主要生物学作用是促进细胞核中DNA链的合成与延伸，促进细胞的生长和增殖4；而原癌基因c-myc是一种重要的核蛋白调控基因，与细胞的增殖密切相关5。PCNA和c-myc基因表达水平的降低说明了Losartan可抑制VSMC的增殖。但是，值得注意的是在Losartan

14、 的作用浓度(10-5g/L)低于正常血浆用药浓度时，与对照组相比，VSMC中PDGF和c-myc基因表达的平均荧光值降低的幅度并不很大，但仍存在差别。这说明Losartan对VSMC增殖具有较强的抑制作用。PDGF是原癌基因c-sis的表达产物，其主要的生物学作用是通过自分泌或旁分泌机制，促进中膜平滑肌细胞向内膜的迁移和增殖6。本实验中，Losartan对体外培养VSMC中PCNA和c-myc基因的表达均具有一定的抑制作用，但对PDGF的作用却并不明显，这与Losartan作用浓度低有关，还是由于不同浓度的Losartan对各种癌基因表达的诱导作用存在着一定的差异，尚有待进一步研究和探讨。综

15、上所述，Losartan作为特异性地拮抗血管紧张素II受体拮抗剂的降压作用与其对VSMC增殖的抑制有关，并涉及癌基因调控的细胞及分子机制。本课题受1998年广东省自然科学积极基金资助(980466)作者单位：陈敏生广州医学院第二附属医院心内科510182刘健康组织胚胎学教研室黄少华第一附属医院心脏病研究室参考文献1杨亚东，李倩虹，张新波.原发性高血压相关基因的研究进展.中国高血压杂志，1993，1：1-5.2John H, Bauer, Garry PR. The angiotensin II type I receptor antagonists, a new class of antihy

16、pertensive drugs. Arch Inren Med, 1995，155:1361-1364.3Mizuno K, Tani M, Hashimoto S, et al. Effects of Losartan, a nonpeptide angiotensin receptor antagonist, on cardi9ac hypertrophy and the tissue angiotensin content in spontaneously hypertensive rats. Life Sci,1992,51:367-370.4Siltonen SM, Isola J

17、J, Rantala IS, et al. Intratumour variation in cell proliferation in breast carcinoma as determined by antiproliferating cell nuclear antigen monoclonal antibody and automated image analysis. Am J Clin Pathol, 1993,99:226-229.5Elazer RE, Michael S, Martin G, et al. C-myc in vasculoproliferative disease.Cir Res,1995,76:176-180.6Volkhard L, Cecilia MG, Stephen MS, et al. A subpopulation of smooth muscle cells in injured arteries