《原核表达实验》ppt课件

1、实验一：大肠杆菌表达载体的构实验一：大肠杆菌表达载体的构建及交融蛋白诱导表达建及交融蛋白诱导表达生命科学技术学院生命科学技术学院张忠明张忠明 朱辉朱辉 袁松丽袁松丽2021年年6月月黑曲霉的优化培育黑曲霉的优化培育总总DNA或或RNA的抽提的抽提PCR或或RT-PCR扩增扩增xynB基因基因目的基因的目的基因的TA克隆克隆质粒质粒pMD-xylBEcoRI+XhoI双酶切双酶切凝胶回收试剂盒回收目的片断凝胶回收试剂盒回收目的片断xynB乙醇沉淀回收线性化片断乙醇沉淀回收线性化片断大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体pET-28(a)+ 酶连酶连酶连产物转化酶连产物转化E.coli DH5挑取转化子

2、并抽提质粒验证表达质粒挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒(PCR及酶切验证及酶切验证)28S18S重组表达质粒转化重组表达质粒转化E.coli BL21挑取重组子挑取重组子, 用菌落用菌落PCR方法验证方法验证IPTG诱导促使目的大量蛋白表达诱导促使目的大量蛋白表达细胞破碎及蛋白抽提细胞破碎及蛋白抽提目的蛋白的纯化目的蛋白的纯化蛋白质浓度测定蛋白质浓度测定-Bradford法法目的蛋白的鉴定目的蛋白的鉴定Western biotting交融蛋白诱导表达流程图交融蛋白诱导表达流程图XylBCK100mM IPTG1ml LB+Kan1-I1+I2+I3+ICk+I2-I3-ICk-I37, O/N

3、37 , 2.7h37 , 2.7h37 , O/N30 , 4 h28 , 4 h1ml LB+Kan3ul 150ul3ul 3ul 3ul 50ml LB+Kan IPTG 100mM 运用浓度运用浓度0.1mM Kan 100mg/ml 运用浓度运用浓度50g/ml PBS缓冲液：缓冲液： mM NaCl 2.7mM KCl 10mM Na2HPO4 10mM KH2PO4 试剂及缓冲液：试剂及缓冲液：3SDS缓冲液：缓冲液： 187.5mM Tris-HCl (pH6.8, 25 ) 6% w/v SDS 30% 甘油甘油 0.03% w/v 溴酚蓝溴酚蓝Gel Staining B

4、uffer(每每100ml): 考马斯亮蓝考马斯亮蓝 250 mg 甲醇甲醇 45 ml 乙酸乙酸 10 ml 水水 45 mlGel Destaining Buffer: 甲醇甲醇 100 ml 乙酸乙酸 100 ml 加水至加水至 1000 mlSDS-PAGE胶：胶： 30%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 10% SDS 1.5M Tris-HCl pH8.8 0.5M Tris-HCl pH6.8 10% 过硫酸铵现配过硫酸铵现配 TEMEDTris-甘氨酸电泳缓冲液甘氨酸电泳缓冲液 25mmol/L Tris 250mmol/L 甘氨酸电泳级甘氨酸电泳级PH8.3 0.1% SDS 可配成可配

5、成5储存液备用，在储存液备用，在900ml去离子水中溶解去离子水中溶解15.1gTris碱和碱和94g甘氨酸，然后参与甘氨酸，然后参与50ml 10%w/v的电泳级的电泳级SDA储存液，用去离子水补至储存液，用去离子水补至1000ml。操作步骤操作步骤1： 小规模诱导小规模诱导-挑选正确表挑选正确表达克隆子达克隆子1、从平板上挑取、从平板上挑取1个个pET28-xylB/BL21转化子接种于装有转化子接种于装有2ml LB/Kan Kan浓度浓度50ug/ml培育基的培育基的PA瓶中，瓶中， 37oC， 250rpm，培育过夜；，培育过夜；2、取过夜培育物按、取过夜培育物按1%接种量分别转接二

6、个装有接种量分别转接二个装有20ml LB/Kan的的PA瓶中，瓶中，37 培育约培育约2小时小时40分钟；分钟；3、培育终了后，分别向其中一个瓶参与、培育终了后，分别向其中一个瓶参与IPTG终浓度终浓度0.1mM并标志为并标志为“+I，另一瓶不加，另一瓶不加IPTG标志为标志为“-I，28 培育，培育，250rpm，约，约4小时后搜集菌体；小时后搜集菌体；4、从、从“+I 、“-I培育瓶中各汲取培育瓶中各汲取1ml菌液于两个标有菌液于两个标有“+I 、“-I 的的1.5ml离心管中离心管中,离心搜集菌体离心搜集菌体,10000 rpm、RT、1分钟，去上清，参与分钟，去上清，参与80ul缓冲

7、液和缓冲液和40ul 3SDS上样缓冲液悬上样缓冲液悬浮菌体，浮菌体，-20保管备用。保管备用。1、挑取、挑取1个正确表达目的蛋白的转化子接种于装有个正确表达目的蛋白的转化子接种于装有2ml LB/KanKan浓度浓度50ug/ml培育基的培育基的PA瓶中，瓶中，37oC培育过夜；培育过夜；2、按、按1%接种量接种于接种量接种于50ml LB/Kan Kan浓度浓度50ug/ml中中37 培育约培育约2小时小时40分钟，分钟，OD600=0.4-0.6；前两步与操作；前两步与操作步骤步骤1一样一样3、培育终了后，向三角瓶中参与、培育终了后，向三角瓶中参与IPTG100mM50l，使培，使培育液

8、中育液中IPTG终浓度为终浓度为0.1mM；28 诱导培育，诱导培育，250rpm，约，约4小时后搜集菌体；小时后搜集菌体；4、吸菌液、吸菌液1ml于于1.5ml离心管中，另取离心管中，另取20ml倒入倒入50ml离心管中离心管中,离心搜集菌体离心搜集菌体,8000 rpm，4 ，5分钟去除培育基，参与分钟去除培育基，参与2ml 1PBS缓冲液悬浮菌体，然后分装于缓冲液悬浮菌体，然后分装于2个个1.5ml离心管中，离心管中，10000rpm，离心，离心2分钟，去上清，分钟，去上清，-20保管备用。保管备用。操作步骤操作步骤2： 大规模诱导大规模诱导-大量表达目大量表达目的蛋白的蛋白5、取前面保

9、管菌体参与、取前面保管菌体参与1SDS上样缓冲液，沸水水上样缓冲液，沸水水浴浴5分钟破细胞，室温冷却；分钟破细胞，室温冷却；6、在室温以、在室温以10000rpm离心离心1分钟，取上清液分钟，取上清液10-20ul SDS-PAGE蛋白电泳检测。蛋白电泳检测。附：附：SDS-PAGE胶的制备及蛋白质电泳：胶的制备及蛋白质电泳：12%分别胶配制分别胶配制(5ml):水水 1.6ml30%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 2 ml1.5M Tris-HCl (pH8.8) 1.3ml10% SDS 0.05ml10% 过硫酸铵过硫酸铵 0.05mlTEMED 0.002 ml分别胶配制时，过硫酸铵和分别胶配制

10、时，过硫酸铵和TEMED先不加，将制胶板跟电泳槽装配好，先不加，将制胶板跟电泳槽装配好，制胶板凹面朝向本人方便注胶，然后参与过硫酸铵和制胶板凹面朝向本人方便注胶，然后参与过硫酸铵和TEMED，将胶液混，将胶液混合均匀后注入制胶板中，再参与一定量水饱和正丁醇去除气泡。放置合均匀后注入制胶板中，再参与一定量水饱和正丁醇去除气泡。放置30分钟，待胶完全凝固，去除正丁醇。然后配制积层胶。分钟，待胶完全凝固，去除正丁醇。然后配制积层胶。5%积层胶配制积层胶配制(2ml):水水 1.4ml30%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 0.33 ml0.5M Tris-HCl (pH6.8) 0.25ml10% SDS 0.

11、02ml10% 过硫酸铵过硫酸铵 0.02mlTEMED 0.002 ml积层胶制造方法跟分别胶制造类似，混合均匀后注入胶板，缓慢的插入积层胶制造方法跟分别胶制造类似，混合均匀后注入胶板，缓慢的插入梳子，静置梳子，静置30分钟，胶凝固后取出胶板，撕掉胶条，拔去梳子，再将胶分钟，胶凝固后取出胶板，撕掉胶条，拔去梳子，再将胶板凹面背向本人装好电泳槽。缓慢向内槽倒入板凹面背向本人装好电泳槽。缓慢向内槽倒入Tris-甘氨酸电泳液，使其甘氨酸电泳液，使其没过凹槽，向外槽倒入与内槽持平的电泳液。没过凹槽，向外槽倒入与内槽持平的电泳液。 点样：一切的样品和蛋白点样：一切的样品和蛋白Marker点样前都要沸水

12、浴点样前都要沸水浴5分钟使分钟使蛋白质完全变性。普通的点样量为蛋白质完全变性。普通的点样量为10-20ul。 点样终了后即可开场电泳，先以点样终了后即可开场电泳，先以80伏电压跑伏电压跑15-20分钟，蛋分钟，蛋白质经过积层胶后，改换到白质经过积层胶后，改换到120伏，待溴酚蓝接近分别胶底伏，待溴酚蓝接近分别胶底部后停顿电泳，取下胶板，小心撬开胶板割取分别胶，放入部后停顿电泳，取下胶板，小心撬开胶板割取分别胶，放入染色皿中，参与一定染色液没过胶面即可。置于摇床上染色皿中，参与一定染色液没过胶面即可。置于摇床上染色染色30-45分钟。分钟。 染色终了后，回收染色液，参与脱色液，摇床脱色数次，前染

13、色终了后，回收染色液，参与脱色液，摇床脱色数次，前面几次可以时间较短，第一次约面几次可以时间较短，第一次约10分钟，依次时间略微延伸，分钟，依次时间略微延伸，最后一次可以过夜脱色。最后一次可以过夜脱色。实验二：大肠杆菌细胞破碎及蛋实验二：大肠杆菌细胞破碎及蛋白浓度测定白浓度测定1、取出保管的诱导后的细胞、取出保管的诱导后的细胞10ml，在冰上缓慢融化后，在冰上缓慢融化后，参与参与1mlPBS缓冲液；缓冲液；2、置冰上用超声波破碎细胞，将超声波发射探头插入菌液、置冰上用超声波破碎细胞，将超声波发射探头插入菌液中，开场超声，中，开场超声，10 sec/次，间歇次，间歇15 sec防止过度产热，防止

14、过度产热，反复数次普通反复数次普通5-6次直至溶液变清亮；一切过程均需在次直至溶液变清亮；一切过程均需在冰上进展；冰上进展；3、在、在4、13000rpm离心离心20分钟，可溶性蛋白存在于上清分钟，可溶性蛋白存在于上清液中，不溶性蛋白存在于沉淀中；液中，不溶性蛋白存在于沉淀中；4、取上清液于另一干净的、取上清液于另一干净的1.5ml离心管中，取离心管中，取40l上清液测上清液测定总蛋白的浓度。定总蛋白的浓度。 采用采用BSA法测定蛋白浓度法测定蛋白浓度Bradford, 1972，首先，首先作好规范曲线，然后将样品测得的作好规范曲线，然后将样品测得的OD在规范曲线上比较后在规范曲线上比较后获得

15、样品蛋白质浓度。获得样品蛋白质浓度。 方法：方法：1、完全溶解、完全溶解BSA蛋白规范品蛋白规范品(5mg/ml)，用，用PBS将规范品稀释将规范品稀释成成100-500 g/ml的溶液的溶液2、分别取、分别取20L的不同浓度的的不同浓度的BSA蛋白规范品溶液参与到蛋白规范品溶液参与到1mL考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250试剂中，摇匀，室温反响试剂中，摇匀，室温反响5 min后，在后，在595 nm处测定光吸收值。处测定光吸收值。3、以光吸收值为纵坐标，规范蛋白含量为横坐标，绘制规、以光吸收值为纵坐标，规范蛋白含量为横坐标，绘制规范曲线。范曲线。 蛋白浓度规范曲线的绘制蛋白浓度规范曲线的绘制 1、

16、取出保管的诱导后的细胞、取出保管的诱导后的细胞10ml，在冰上缓慢融化后，在冰上缓慢融化后，参与参与1mlPBS缓冲液；缓冲液；2、置冰上用超声波破碎细胞，将超声波发射探头插入菌液、置冰上用超声波破碎细胞，将超声波发射探头插入菌液中，开场超声，中，开场超声，10 sec/次，间歇次，间歇15 sec防止过度产热，防止过度产热，反复数次普通反复数次普通5-6次直至溶液变清亮；一切过程均需在冰次直至溶液变清亮；一切过程均需在冰上进展；上进展；3、在、在4、13000rpm离心离心20分钟，可溶性蛋白存在于上清分钟，可溶性蛋白存在于上清液中，不溶性蛋白存在于沉淀中；液中，不溶性蛋白存在于沉淀中；实验

17、三：表达蛋白的纯化实验三：表达蛋白的纯化4、细胞破碎上清液中，参与、细胞破碎上清液中，参与Ni-NTA树脂柱，在树脂柱，在4下结合下结合1h(离心管平放在冰盒中，每离心管平放在冰盒中，每5分钟摇动一次防止柱子分钟摇动一次防止柱子堆积在底部堆积在底部)；然后；然后5000 r/min离心离心1 min移除上清液；移除上清液；5、4条件下条件下50 mmol/L pH7.5磷酸缓冲液磷酸缓冲液1ml(1XPBS buffer)5min/次洗四次，参与次洗四次，参与40 mmol/L咪唑咪唑 (imidazole)1xPBS缓冲液洗脱缓冲液洗脱10min除杂蛋白除杂蛋白 ，离心弃上，离心弃上清；保管

18、清；保管Ni-NTA柱；柱；6、参与、参与500l 100 mmol/L咪唑咪唑 (imidazole)、 50 mmol/L pH7.5磷酸缓冲液磷酸缓冲液(1XPBS buffer)洗脱液，在洗脱液，在4条件下洗条件下洗涤涤30min后后5000 r/min离心离心1 min，用移液器小心搜集上清，用移液器小心搜集上清应尽量防止吸到离心管底部的应尽量防止吸到离心管底部的Ni-NTA柱，置于新的柱，置于新的1.5ml离心管中离心管中(另外取出另外取出40l样品，测浓度，样品，测浓度，-20储存储存备用。备用。 实验四：表达蛋白的鉴定实验四：表达蛋白的鉴定-western杂交杂交操作步骤操作步

19、骤1 蛋白质电泳蛋白质电泳 取取-20保管的纯化好的蛋白样品洗脱搜保管的纯化好的蛋白样品洗脱搜集的上清集的上清50l，用，用1xPBS十到五十倍稀十到五十倍稀释；取释；取50l稀释液，参与稀释液，参与25l 3SDS上样上样缓冲液，沸水水浴缓冲液，沸水水浴5分钟；分钟； 各样品在室温以各样品在室温以10000rpm离心离心1分钟，取分钟，取上清上清10-20ul SDS-PAGE蛋白电泳。蛋白电泳。操作步骤操作步骤2 2 蛋白质的半干式电转移蛋白质的半干式电转移戴手套操作戴手套操作将蛋白胶的积层胶切除将蛋白胶的积层胶切除(当胶上的样品较少当胶上的样品较少时，不含目的蛋白的胶应都切除，使剩时，不

20、含目的蛋白的胶应都切除，使剩下的胶块尽能够小下的胶块尽能够小)，然后浸入，然后浸入Towbin buffer中平衡；中平衡；预先预备公用的滤片预先预备公用的滤片2张张(或或18张滤纸张滤纸)和和1张张硝酸纤维素滤膜，其大小都应与凝胶大硝酸纤维素滤膜，其大小都应与凝胶大小吻合；用铅笔在滤膜一角做好标志；小吻合；用铅笔在滤膜一角做好标志；将将 1张滤片张滤片(或或9张滤纸张滤纸)在在Towbin buffer中中浸润后放置在电极上浸润后放置在电极上(如用如用9张滤纸那么张滤纸那么应逐张叠放整齐应逐张叠放整齐) ，用玻璃棒挤出一切气，用玻璃棒挤出一切气泡。详细摆放顺序见以下图泡。详细摆放顺序见以下图

21、 于于Towbin buffer中浸润硝酸纤维素滤膜，然后置于滤纸中浸润硝酸纤维素滤膜，然后置于滤纸/片片上，排出气泡；上，排出气泡； 然后将平衡好的蛋白胶置于硝酸纤维素滤膜上，排出气泡；然后将平衡好的蛋白胶置于硝酸纤维素滤膜上，排出气泡； 再依次将另外再依次将另外9张滤纸张滤纸(1张滤片张滤片)在在Towbin buffer中浸润后放中浸润后放置在蛋白胶上。置在蛋白胶上。 加上阴极电板，加上阴极电板，25V电压转移电压转移40分钟。分钟。 转移完成后，取出转移完成后，取出NC膜，在膜，在TBS漂洗漂洗5min，置入丽春红染，置入丽春红染液中染色，出现蛋白条带后，用自来水漂洗液中染色，出现蛋白

22、条带后，用自来水漂洗1min，用铅笔标，用铅笔标志处蛋白质志处蛋白质Marker的位置，然后参与的位置，然后参与TBS漂洗至颜色消逝；漂洗至颜色消逝； 9层滤纸电转缓冲液层滤纸电转缓冲液9层滤纸电转缓冲液层滤纸电转缓冲液阳极阳极(+)(+)阴极阴极(-)(-)Trans-Blot SD with Gel Sandwich 操作步骤操作步骤3 3 膜的封锁膜的封锁 用含有用含有5脱脂牛奶的脱脂牛奶的TBS-T封锁封锁NC膜含有膜含有0.1%吐温吐温20的的1倍的倍的TBS，在室温条件下孵，在室温条件下孵育育1至至2小时小时(引荐在引荐在4条件下孵育过夜条件下孵育过夜)； 用用TBS-T漂洗：漂洗

23、：15分钟，分钟，1次；次；5分钟，分钟，2次。次。 在室温条件下，将在室温条件下，将NC膜转入含有膜转入含有1脱脂牛奶脱脂牛奶和适宜稀释度和适宜稀释度1:1500的一抗的的一抗的TBS-T溶溶液中，孵育液中，孵育1至至2小时；小时； 用用TBS-T漂洗：漂洗：15分钟，分钟，1次；次；5分钟，分钟，3次。次。 操作步骤操作步骤4 一抗杂交一抗杂交操作步骤操作步骤5 5 二抗进展杂交二抗进展杂交 在室温条件下，将在室温条件下，将NC膜转入含有膜转入含有1脱脂脱脂牛奶和适宜稀释度的二抗的牛奶和适宜稀释度的二抗的TBS-T溶液中溶液中(1:5000)，孵育，孵育1小时；小时； 用用TBS-T漂洗：

24、漂洗：15分钟，分钟，1次；次；5分钟，分钟，3次。次。 用用TBS漂洗：漂洗：5分钟，分钟，3次次操作步骤操作步骤6 DAB3, 3二氨基联苯二胺显色检二氨基联苯二胺显色检测测用用DBA显色显色 KIT20X显色操作步骤：显色操作步骤：将将50ul50ul浓缩液浓缩液A A一滴稀释于一滴稀释于1ml PH7.01ml PH7.0蒸馏水中蒸馏水中摇匀。摇匀。再向其中参与再向其中参与B B液液 DABDAB溶液和溶液和C C液浓缩过氧化液浓缩过氧化氢溶液各一滴，再次混匀，此液需现用现配，配氢溶液各一滴，再次混匀，此液需现用现配，配好后避光保管，好后避光保管，30min30min内运用。内运用。将

25、洗脱好的硝酸纤维素膜转移到一块剪好的保鲜膜将洗脱好的硝酸纤维素膜转移到一块剪好的保鲜膜上，然后将配好的显色液用移液器淋到硝酸纤维素膜上，然后将配好的显色液用移液器淋到硝酸纤维素膜上正面，室温上正面，室温1min1min内将在目的条带处看到棕红色内将在目的条带处看到棕红色条带。条带。Towbin Buffer： 25mM Tris pH8.3 192mM glycine 20% methanol 10TBS缓冲溶液缓冲溶液1L Tris-Base 24.2g ， NaCl 80g ，pH7.6缓冲液配方：缓冲液配方：第一组，第二组，第三组第一组，第二组，第三组 配配YPD液体培育基液体培育基1.

26、5L 葡萄糖葡萄糖 20g，酵母提取物，酵母提取物 10 g，蛋白胨，蛋白胨(Peptone)20g， pH6.5定容至定容至1L。 分装分装 20ml/250ml三角瓶，三角瓶，70瓶瓶第四组，第五组，第六组，第七组第四组，第五组，第六组，第七组 配配BMMY液体培育基液体培育基3L 酵母提取物酵母提取物 10 g，蛋白胨，蛋白胨(Peptone)20g ，酵母氮碱，酵母氮碱3.4g， 硫酸铵硫酸铵 10g，用，用pH7.0的的0.1M的磷酸钾缓冲液定容至的磷酸钾缓冲液定容至1L。 pH7.0 0.1mol/L磷酸钾缓冲液：磷酸钾缓冲液：1mol/L K2HPO4 61.5ml， 1mol/L KH2PO4 38.5ml，定容至，定容至1L，调理，调理pH，定容