乌头简单序列重复区间扩增条件的优化

1、乌头简单序列重复区间扩增条件的优化         09-09-06 11:29:00     编辑：studa20                      作者：张岳峰 万里翔 侯大斌【摘要】  目的保证乌头ISSR-PCR的稳定性、提高对乌头遗传多样性,

2、亲缘关系分析、种质鉴定的可靠性。方法收集西南地区23个乌头材料，以Mg2+，dNTP，引物和聚合酶建立L9（34）正交设计，并同时考察模板和甲酰胺浓度及退火温度，建立适宜的ISSR-PCR体系。结果以Mg2+2.0 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、引物0.3 mol/L、rTaq酶1U、模板1.5 ng/l、甲酰胺2%及退火温度（Tm-3）的ISSR反应体系最优。结论实验建立的ISSR-PCR体系反应稳定，能用于乌头的ISSR分析。 【关键词】  乌头 简单序列重复区间 优化Abstract：ObjectiveTo keep the stability of ISSR

3、_PCR and reliability of genetic diversity, sibship analysis and source assessing for Aconitum carmichael Dexb. Methods23 kinds Aconitum carmichael Dexb. samples in southwest of China were selected to carry out 4 factors(Mg2+，dNTP，primer and Taq polymerase) and 3 levels(concentration) orthogonal desi

4、gn experiment. Meanwhile separated experiments for forma-mide, template concentration and annealing temperature affect were carried out.ResultsISSR_PCR reaction system could be well established through orthogonal design experiment by 23 samples ISSR-PCR reaction assessing.ConclusionThe optimized ISS

5、R-PCR reaction system can be stably used for Aconitum carmichael Dexb. genetic analysis.Key words：Aconitum carmichael Dexb.;   Inter-Simple Sequence Repeat;   Optimization    乌头Aconitum carmichael Dexb为毛茛科乌头属植物，别名五毒根1。为毛茛科植物乌头，在中国西南地区四川盆地有较大栽培面积，其母根叫乌头或川乌，为镇痉剂，可用于治

6、风痹、风湿神经痛。侧根（子根）入药，称附子(Radix Aconiti Lateralis Preparata)。   ISSR-PCR技术，简单序列重复区间(Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR)，是Zietkiewicz等21994年创建的，引物是根据基因组内某一重复序列设计出一系列特异性引物，包括双核苷酸、三核苷酸和四核苷酸等微卫星片段。这种技术除具有RAPD优点外，比RAPD技术更具有明确的针对性，同时由于PCR扩增条件中的退火温度较高(50左右)，保证了PCR扩增的可重复性，结合了SSR和RAPD的优点。可以快速、高效和灵敏地检测出基

7、因组DNA的多态性, 有很好的重复性, 操作简单、成本较低, 适合大样本的检测3。关于野生乌头的RAPD的优化与遗传分析已有报道4，川乌ISSR遗传分析也有报道5。因此建立稳定好、重复性强的ISSR反应体系对乌头遗传学、种质资源、分类学与种系发生学等方面具有重要意义。1  材料    从四川绵阳安县晓坝（海拔850 m）已建立的附子资源圃200份附子种质资源类型中筛选出优势代表材料23份（见表1），上年种植，200707采摘顶部功能嫩叶数片，置4保存，提取DNA所用。表1  乌头样品引种来源（略）2  方法2.1  DNA提

8、取采用陈亮6并稍加改良的CTAB方法提取DNA，通过紫外和琼脂糖电泳检测其纯度、浓度和完整性后，用以ISSR-PCR优化实验。2.2  反应体系正交实验 采用L9(34)正交实验设计，对Mg2+（大连TaKaRa提供），dNTP（TaKaRa），引物（上海生工提供）和rTaq聚合酶（TaKaRa）进行4因素3水平7筛选，方案如表2。根据表2制备总体积为20 l的反应体系，体系中还存在1×PCR缓冲液和30 ng模板DNA，其余用过柱超纯水补充，引物选用哥伦比亚UBC系列847号引物，在德国Eppendorf Mastercycler Gradient仪上扩增，PCR扩增程序

9、为：94预变性3 min，94变性30 s，Tm8473(52.8-3=49.8)退火45 s，72延伸2 min，40个循环；72延伸10 min，4保存。    扩增结束后，PCR产物在1.5%的含溴化乙锭(0.5 g/ml)琼脂糖凝胶电泳，电极缓冲液为0.5×TBE,电压3V/cm,电泳结束在Bio-Rad凝胶成像系统分析并拍照。2.3   模板DNA浓度筛选   应用表2中最佳组合，选用引物UBC846，20 l体系中模板浓度分别置为0.5，1.5，3.0 ng/l和6 ng/l共4个浓度处理。2.4

10、60; 甲酰胺对扩增稳定性实验选定的正交最佳反应体系,选用引物UBC846，20 l体系中设空白对照；甲酰胺(绵阳荣盛AR)浓度分别为0.5%，1.0%，2.0%和4.0%。表2  ISSR-PCR正交实验设计（略）2.5  不同复性温度影响   根据正交最佳体系，结合引物UBC846用梯度PCR仪设定PCR退火温度梯度范围4555。3  结果3.1  PCR正交实验分析PCR扩增结果是由Mg2+，dNTP引物和DNA聚合酶综合交互共同决定的，从图1中可以看出，各种因素的浓度差异，扩增结果有显著的差别。其中8，7，9号谱带依次增强，其

11、原因是由于rTaq酶的增加。2，4，8酶量相同，PCR产物随Mg2+和dNTP的浓度的增加而增加，当浓度过高时候就会产生条带亮度增大，出现模糊的边缘，甚至产生背景使条带的混连。3号谱带较弱可能是因为Mg2+浓度过低而dNTP浓度偏高，由于dNTP能够和Mg2+结合使得游离Mg2+进一步减少，影响了rTaq的活性。5，7，9号谱带弥散是因为Mg2+浓度过高而引起。在dNTP浓度相同时，过量的酶或Mg2+会造成严重的背景干扰和非特性产物的扩增。第6泳道非常清晰，背景很小。通过比较以特异谱带多态性高、背景干扰低、主带清晰、副带明显为原则，同时考虑实验成本，即采用Mg2+2.0 mmol/L，dNTP

12、 0.25 mmol/L，引物0.3 mol/L，rTaq聚合酶1 U的最佳20 l反应体系。图1  正交设计ISSR_PCR反应结果（略）3.2   模板浓度的确定   由图2可以见，当20 l反应体系中，模板量从0.56 ng/l均有扩增，但到了浓度达到6 ng/l条带变得异常模糊，1.5 ng/l浓度的模板扩增效果很清楚，因此反应体系中模板浓度确定为1.5 ng/l。图2  不同模板浓度对扩增影响（略）3.3  甲酰胺浓度的确定在筛选引物的时候，发现有些引物尤其是Tm较低的非锚定引物，扩增时有非特异拖带，其原因是引物在模板上滑动的结果。因此在体系中加入甲酰胺，结果如图3，表明0.5%浓度过低，几乎无效果，其它浓度均有一定的效果，其中以2%降低背景效果最明显。图3  不同甲酰胺浓度对扩增影响（略）3.4