人脂肪组织来源干细胞生物学特性研究_图文

1、第50卷第5期2010年9月大连理工大学学报J o u r n a l o f D a l i a n U n i v e r s i t y o f T e c h n o l o g y V o l .50,N o .5S e pt .2010文章编号:1000-8608(201005-0649-07人脂肪组织来源干细胞生物学特性研究朱艳霞1,刘天庆*1,宋克东1,姜丽丽1,马学虎1,崔占峰2(1.大连理工大学干细胞与组织工程研发中心,辽宁大连116024;2.牛津大学工程科学系组织工程与生物处理中心,英国牛津O X 13P J 摘要:为进一步研究脂肪组织来源的干细胞增殖和多向分化潜能,用

2、改进的方法分离脂肪组织来源的干细胞,通过c c k -8检测细胞的增殖能力、流式细胞仪检测干细胞相关表面标记的表达、R T -P C R 对干细胞相关基因的表达进行分析;并对分离得到的细胞向脂肪、软骨、骨及心肌细胞诱导,观察其多向分化能力.结果显示:采用改进的方法,从400600m g 脂肪组织可收获约5×105个脂肪组织来源的干细胞,并且细胞可以重叠生长1个月以上,期间细胞表现出几个对数增殖期;所有增殖的细胞其干细胞相关表面标记都呈阳性表达;转录因子N a n o g 、O c t -4、S o x -2和R e x -1也呈强阳性表达;A D S C s 向脂肪、骨、软骨和心肌细

3、胞诱导分化后能够分别表达脂滴、碱性磷酸酶和矿化结节、富含黏多糖的软骨细胞外基质,以及少量心肌特异性连接蛋白C o n n e x i n -43,表明A D S C s 具有向多个胚层细胞分化的能力.此外,为获得更多具有强增殖能力的细胞,根据生长曲线,对细胞进行每14d 传代而非传统的5d 传代,发现所得到的细胞仍保持强的增殖能力、干细胞表型以及更强的多向分化潜能.关键词:脂肪;干细胞;增殖;倍增时间;多向分化潜能中图分类号:Q 813.1;R 318文献标志码:A收稿日期:2008-08-10;修回日期:2010-07-20.基金项目:国家自然科学基金资助项目(30670525;大连理工大学

4、青年教师培养基金资助项目(893228.作者简介:朱艳霞(1980-,女,博士生;刘天庆*(1959-,男,教授,博士生导师,E -m a i l :l i u t qd l u t .e d u .c n .0引言自2001年Z u k 等1证实吸脂获得的脂肪组织中存在具有多向分化潜能的细胞群,脂肪干细胞(a d i p o s e -d e r i v e d s t e m c e l l s ,A D S C 逐渐被人们认识并进入干细胞研究领域.A D S C 具有与骨髓间充质干细胞相似的生物学特性,并且脂肪组织分布广泛、体内储备量大,可以多次取材并且损伤小,因此,A D S C 作为

5、组织工程和再生治疗的种子细胞前景十分广阔.目前国内外对A D S C 体外增殖及定向诱导分化能力认识还存在分歧,研究者们通过不同方法获得了不同量的脂肪干细胞1、2,要想获得高质、高量的A D S C ,必须建立一套更简便有效的分离培养方法.另外,大多数研究显示A D S C 的增殖周期是67d ,然而有研究表明A D S C 在增殖2周过程中,细胞的蛋白合成率和总蛋白量一直持续增加3.因此,A D S C 的生长特性还有待进一步阐明.本实验改进现有的A D S C 体外分离培养方法,对其获得率、体外增殖能力等进行研究,以期A D S C 为种子细胞的细胞治疗和组织构建提供细胞学基础.1材料和方

6、法1.1脂肪干细胞的分离培养自外科手术患者(年龄1660岁皮下获取正常脂肪组织,约500m g ,无钙镁H a n k s 液冲洗,用眼科剪尽量剪破脂肪组织中肉眼可见的细小血管,冲洗血液后剪碎脂肪组织,移入大玻璃管中,加入0.25%胰蛋白酶(s i g m a 和0.1%胶原酶(I 型,s i g m a (体积比11,37恒温摇床振荡消化20m i n .此时液面分为3层:上层为黄色油状脂肪细胞层,中层为脂肪组织层,下层为含单个核细胞的液体.吸出下层液体移入含完全培养基(10%胎牛血清(h y c l o n e +高糖D M E M (g i b c o 的离心管中终止消化.在剩余脂肪中加

7、入新的胰酶和胶原酶,重复以上步骤继续消化,重复23次,将收集到的液体1500r /m i n 离心10m i n ,去除悬浮的脂肪细胞和脂滴,去上清,向细胞沉淀中加入含10%胎牛血清D M E M 重悬细胞,移入培养瓶中,37、5%C O 2培养箱孵育,每23d 换液.细胞达到100%融合时,用0.25%胰酶和0.04%E D T A (体积比11消化传代.1.2细胞形态学观察使用倒置显微镜(I X 70-131,O L Y M P U S 观察细胞生长,并对传代贴壁生长在培养瓶中的脂肪干细胞的生长、纯化情况及增殖进行连续观察、摄像.1.3细胞增殖动力学分析将第4代A D S C 以不同密度6

8、.25×104、1.25×105、2.50×105、5.00×105、1.00×106和2.00×106c e l l s /m L 种于96孔板内,获得细胞密度与光密度值的标准曲线.以5.00×103c e l l s/m L 的密度接种细胞并分别检测和绘制第3、7和15代细胞的生长曲线.采用c c k -8测量细胞增殖,每100L 培养液中加10L 无菌c c k -8,孵育3h 后在酶联免疫检测仪上测各孔450n m 的光吸收值,参比波长630n m.每组设置3个平行对照,实验重复3次.当细胞传至20代时,分别将20代

9、细胞按传统的每5d 传代1次(99%融合和每14d 传代1次(此时细胞重叠生长,两种传代方法传代至25代时,分别绘制2个25代细胞的生长曲线.1.4累计群体倍增时间根据生长曲线的指数增殖期计算群体倍增时间.群体倍增时间T d =T ×l g 2/l g (N t /N 0,T 代表生长曲线中的指数增殖时间段,N 0是接种时的细胞数,N t 是指数增殖末期的细胞数.据此公式计算25代细胞的群体倍增时间T d .1.5细胞表面分子测定取第4、20及2个25代细胞检测其干细胞相关表面标记的表达,操作步骤如下:培养的脂肪干细胞经过消化离心(1000r /m i n ,5m i n 后细胞重悬

10、;细胞计数后将细胞浓度调整为1×107c e l l s/m L ,分别与人抗C D 13-P E 、C D 29-P E 、C D 34-F I T C 、C D 44-F I T C 、C D 45-F I T C 、C D 105-F I T C 、C D 166-P E 和H L A -D R -P E 作用20m i n ,P B S 洗涤2次后用P B S 重悬细胞,流式细胞仪(B D ,S a n J o s e ,C A ,U S A 进行检测.1.6逆转录聚合酶链式反应(R T -P C R 分别提取第4、20、30及2个25代细胞的总R N A ,用合成第1链c

11、D N A 试剂盒(T a K a R a,日本逆转录合成c D N A 、N a n o g、O c t -4、S o x -2和R e x -1的引物分别进行扩增,G A P D H 作为参照.P C R 产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,S c i o n I m a ge 图像分析软件对电泳条带进行分析.1.7多向分化潜能的检测1.7.1成脂肪诱导取第4代及2个25代细胞,以1×105c e l l s /m L 的密度接种于24孔板中.当细胞贴壁生长达80%融合时,换成脂肪诱导试剂1,对照组加常规培养液.诱导14d 进行油红染色以观察细胞脂滴形成情况.1.7.2成骨诱导当细胞

12、贴壁生长达80%融合时,换成骨诱导试剂1.细胞诱导培养1周时进行钙钴法碱性磷酸酶(A L P 染色,3周进行V o nK o s s a 染色,干燥后镜下观察.1.7.3成软骨诱导取第4代及2个25代细胞,调整细胞密度2×107c e l l s /m L ,取10L 滴于24孔板内,于37培养箱孵育3h 后加软骨诱导剂1.诱导培养2周后进行甲苯胺蓝染色,干燥后显微镜下观察.1.7.4成心肌诱导取第4代及2个25代细胞,以1×105c e l l s /m L 的密度接种于24孔板中.当细胞贴壁生长达80%融合时加9m o l /L 5-氮胞苷,作用24h 后换新鲜培养基继

13、续培养4周.用心肌特异性连接蛋白C o n n e x i n -43进行免疫荧光检测,荧光显微镜下观察.1.8统计学分析采用S P S S 12.0软件进行统计学处理,所有数据以均数±标准差表示,组间比较采用t 检验.P <0.05为有显著性差异.2结果2.1细胞形态接种后A D S C 在24h 内开始贴壁,初为短梭形,细胞大小不等,核浆比例较大.24d 可见细胞伸展,大多数细胞为长梭形,形态类似成纤维细胞,核椭圆形,较大(图1(a .原代培养的细胞34d 即达90%融合,传代后第3代细胞生长出现方向性(图1(b ;体外培养20代以后,细胞的增殖速度无明显减慢,细胞形态无明

14、显改变(图1(c ;30代以后的细胞体积明显增大(图1(d .2.2细胞增殖动力学在本文的培养条件下,A D S C 可传至30代以上.从图2(b 可以看出在最初3dA D S C 处于生长适应期,第4d 开始细胞进入对数生长期,然而第8d 后细胞处于生长停滞期.但与其他研究结果不同的是细胞并未出现接触抑制,而是继续增056大连理工大学学报第50卷殖到第10d时达到又一个增殖峰值.接下来的几天,细胞数量虽然有所减少,第12d后细胞又进入另一个对数增殖期.从图2还可以看出,随着传代次数的增加细胞的增殖能力有所下降.图2(c显示了两种传代方法得到的第25代细胞的生长曲线.与图2(b类似,这两种细胞

15、的生长曲线表现出多个对数增殖期和增殖峰值,两种方法得到的25代细胞都具有较强的增殖能力 .图1体外培养的脂肪干细胞形态学改变F i g.1M o r p h o l o g yc h a n g eo fh A D S C sf r o ms u b c u t a n e o u sf a tt i s s u ec u l t u r e di nv i t r o图3对应于生长曲线不同时刻脂肪干细胞形态学改变F i g.3M o r p h o l o g yc h a n g e so fh A D S Ci na c c o r d a n c ew i t ht h eg r o

16、w t hc u r v e s1 5 6第5期朱艳霞等:人脂肪组织来源干细胞生物学特性研究 A D S C P 4A D S C P 20C D 13P E 99.44%(+91.16%(+C D 29P E 78.50%(+74.80%(+C D 34F I T C (-(-C D 44F I T C 83.43%(+83.43%(+C D 45F I T C (-(-C D 105F I T C 68.50%(+60.76%(+C D 166P E 52.91%(+48.98%(+H L A -D R P E(-(-都呈阴性表达.第4代细胞的阳性表达率稍高于第20代.本文还发现每隔14d

17、 传代得到的25代细胞干细胞相关表面标志的表达率要高于常规5d 传代得到的25代细胞的表达率(P <0.05.2.4转录因子的表达第4和20代细胞转录因子N a n o g、O c t -4、S o x -2和R e x -1都呈阳性表达,两者的表达率R 没有显著性差异.第30代细胞N a n o g 、O c t -4、S o x -2和R e x -1m R N A 虽然也呈阳性表达,但表达率明显低于其他两代细胞(P <0.05(图5(a 、6(a .每14d 传代得到的25代细胞N a n o g、O c t -4、S o x -2和R e x -1的表达率明显高于每5d 传

18、代得到的25代细胞的表达率(图5(b 、6(b .表2两种传代方法得到的25代细胞表面C D 标志的表达T a b .2E x pr e s s i o n o f c e l l s u r f a c e C D m a r k e r s o f A D S C o f p a s s a ge 25w i t h t w o s u b c u l t u r e m e t h o d s 抗体结合的荧光P 25(5P 25(14C D 13P E 96.80%(+99.89%(+C D 29P E 70.80%(+85.70%(+C D 34F I T C (-(-C D 44F

19、I T C 41.03%(+53.37%(+C D 45F I T C (-(-C D 105F I T C 32.61%(+48.10%(+C D 166P E 28.54%(+48.15%(+H L A -D R P E(-(- 图5不同代数脂肪干细胞转录因子m R N A的表达情况F i g .5T r a n s c r i p t i o n f a c t o r s m R N A e x pr e s s i o n i n h A D S C o f d i f f e r e n t p a s s a ge s 2.5多向分化潜能2.5.1成脂肪潜能A D S C s 经

20、脂肪诱导液向脂肪诱导分化5d 后,胞浆内出现少量脂滴并逐渐聚集.8d 后,细胞形态发生明显改变,从长梭形类成纤维细胞外观逐渐变圆,并且开始出现充满脂滴的细胞.脂肪分化诱导2周后出现了大量的脂滴(图7(a 1.油红“O ”染色后细胞内出现大量256大连理工大学学报第50卷红染颗粒(图7(a2、(a3、(a4,证明镜下所见细胞内颗粒确为脂滴.另外,从半定量分析结果(图8可知,第25代细胞成脂肪能力明显弱于第4代细胞.而2个25代细胞的成脂肪潜能没有显著性差异. 2.5.2成骨潜能A D S C s成骨诱导后约7d长满单层,生长略慢.细胞多为梭形,随时间延长,密度增高,细胞呈多层生长,细胞外分泌基质

21、增多.经A L P染色后见第4代细胞具有较强的碱性磷酸酶的活性(图7(b2,而第25代细胞诱导7d后碱性磷酸酶的活性明显低于第4代(图7(b3、7(b4. 14d时有局灶型点状钙化斑形成,21d时形成明显的矿化结节沉积,随诱导时间增加,结节状沉积愈加明显,颜色加深.V o nK o s s a染色显示结节状沉积为黑色(图7(c2、(c3、(c4,证实了结节状沉积为钙盐沉积.同样,第25代细胞形成的钙化结节明显少于第4代细胞.2个25 代细胞碱性磷酸酶活性图7脂肪干细胞多向分化潜能的检测F i g.7M u l t i-d i f f e r e n t i a t i o np o t e n

22、 t i a l so fh A D S C st o w a r dm e s o d e r m a la n de n d o d e r m a ll i n e a g e s356第5期朱艳霞等:人脂肪组织来源干细胞生物学特性研究 大 连 理 工 大 学 学 报 第 卷 和钙化结节形成都没有显著性差异（ 图 ） 细胞 成软骨潜能 经软骨诱导液培养后， 生长相对变慢， 细胞由成纤维样变为椭 体积增大， 圆形及三角形， 有的呈肾 形 （ （ ） 导 培 养 图 ）诱 甲 可 见 细 胞 周 围 有 基 质 分 泌 苯 胺 蓝 染 色 后， 可见 大 量 异 染 性 基 质， 蓝 紫 色

23、 （ （ ） 呈 图 、 （） （） ， 见 、 ） 表现 为 软 骨 细 胞 分 化 特 点（ 图 ） 但 个 代细胞成软骨潜能没 有 显 著 性 差 异， 都 明显低于第 代细胞 成心肌潜能 氮胞苷作用 ， 继续培 养 周后细胞重 叠 生 长， 并 没 有 发 现 明 显 的 形 但 态学改变和自发 搏 动 的 细 胞 光 染 色 后 显 微 镜 荧 下观察， 代 少有的几个细胞出现 绿 色 第 荧光（ ） ， 第 代 细 胞 诱 导 染 色 后 未 见 图 （ ） 而 绿色荧光（ ） （） 图 （ 、 ） 峰 如此强的增殖能力是以前报道 、 中从 未出现过的 虽然 体 外 长 期 传 代

24、 培 养 后 仍 能 保 持 但 较强的增殖能力， 还 是 随 着 传 代 次 数 的 增 加 有 所下降， 表明传代 时 胰 酶 的 作 用 会 对 细 胞 造 成 一 定的损伤 为减少胰酶的作用次数， 本文将培养至 或 传 代， 代的细 胞 分 别 按 常 规 传 代， 传至 代时发现每 传代得到的细胞增殖力 并 略高于每 传 代 得 到 的 细 胞， 且 细 胞 数 量 是 常规传代的 倍 本文所培养的 其 和 都 呈 阴性表达， 作为排 除 成 纤 维 细 胞 的 表 面 这 标志也是持续阴 性 表 达， 可 以 为 的 自 体 或 同 种 异 体 移 植 提 供 理 论 依 据 时

25、、 同 、 、 和 都 呈 阳 性 表 达， 与 间 其 他 研 究 结 果 一 致 、 充 质 标 志 物 持 续 表 达 说明贴壁 的 可 以 增 殖 而 没 有 丢 失 干 细 胞 相关的表面标志 物， 映 了 向 间 充 质 起 源 反 细胞系的分化能力， 如脂肪、 软骨和成骨 转 录 因 子 、 和 ， 、 特 别是 、 和 在指导干细胞的多向 本 分 化 潜 能 中 起 着 重 要 的 作 用 文 培 养 的 传至 代时仍能表达 、 、 和 而 ， 且 每 隔 传 代 得 到 的 代细胞的表达率 高 于 每 隔 传 代 得 到 的 细 胞 图 脂肪干细胞分化率的半定量分析 因为这 个转录 因 子 启 动、 持 并 调 节 多 能 干 细 维 胞的分化潜能 ， 因此每隔 传代得到的细胞 与常规传代的细胞相比具有更强的分化潜能 讨论 用本 文 改 进 的 分 离 方 法， 脂 肪 组 每 织平均可获得 × 个干细胞， 比文献报道的细 胞获得率 高 倍以上 这是因为本文应用