米诺环素片生物等效性研究

1、米诺环素片生物等效性研究         【摘要】  目的： 研究米诺环素片的药代动力学和相对生物利用度. 方法： 采用HPLC 法测定20名健康男性志愿受试者随机自身交叉单剂量口服米诺环素片和米诺环素胶囊200 mg 后的血药浓度, 得出相应的药时曲线, 计算各药代参数和相对生物利用度. 结果： 半衰期T1/2 分别为（19.53±2.67）和（19.52±2.32）h, 达峰时间Tmax分别为（1.72±0.41）和（1.72±0.70）h, 峰值血浆浓度Cma

2、x分别为（3.404±1.050）和（3.284±0.472） mg/L, 药时曲线下面积 AUC(060 h) 分别为（62.50±11.77）和（56.93±7.33）（mg·h）/L. 两种制剂的药动学参数差异无统计学意义(P0. 05), 受试制剂的相对生物利用度(F)为111.5%. 结论： 两种制剂具有生物等效性. 【关键词】  米诺环素片 生物利用度 色谱法 高效液相0引言盐酸米诺环素(minocycline hydrochloride)为半合成四环素类广谱抗生素, 具高效和长效性, 在四环素类抗生素中, 本品的抗菌作用

3、最强,抗菌谱与四环素相近. 据文献报道1口服本品0.2 g, 14 h内达血药峰浓度, 为2.15.1 mg/L.本品排泄缓慢, 血消除半衰期为11.122.1 h. 我们通过研究健康志愿者口服盐酸米诺环素片（试验制剂）和市售盐酸米诺环素胶囊（参比制剂）血药浓度经时过程,计算出相应的药代动力学参数和相对生物利用度, 对米诺环素片的生物等效性做出评价, 为临床用药提供依据.1材料和方法1.1材料System Gold高效液相色谱仪（Beckman公司，125型二元梯度泵, 7725i手动进样器, 20 L定量环, 168型紫外检测器, 32 Karat TMSoftware色谱工作站）.盐酸米诺

4、环素片, 规格：50 mg/片； 批号：20050322, 西安迪赛生物药业有限责任公司.盐酸米诺环素胶囊(美满), 规格：100 mg/粒；批号：0507056, 惠氏制药有限公司.盐酸米诺环素对照品（西安迪赛生物药业有限责任公司,含量为99.36%）.甲醇、乙腈、三乙胺为色谱纯（美国天地公司）, 水为自制超纯水, 其余试剂均为分析纯.1.2方法1.2.1分组选取20名健康男性志愿受试者, 年龄为2229岁，采用双周期交叉设计（twoperiod crossover design）自身对照试验法, 将20名受试者随机分为2组, 交叉口服受试品盐酸米诺环素片和参比品盐酸米诺环素胶囊,剂量为单次

5、口服200 mg, 清洗期14 d. 每次试验前1 d 1900后即禁食. 试验当日晨空腹, 用250 mL温开水吞服药物. 服药2 h后方可再饮水, 在服药4 h后进食统一低蛋白、低脂肪标准餐, 试验期间禁止剧烈活动, 禁止吸烟、饮酒或含药物、酒精的饮料等.口服药物前抽取空白血样5 mL, 在服药后0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 60 h分别采静脉血5 mL, 置无菌干燥的肝素抗凝试管中, 离心分离出血浆置无菌塑料管中, -20保存, 在14 d内完成盐酸米诺环素的血药浓度测定.1.2.2血药浓度的测定1.2.2.1色谱条件3-4色谱柱为菲罗门

6、公司C8柱（250 mm×4.6 mm, 5 m）；流动相为10 g/L三乙胺溶液（高氯酸酸调节pH至2.05）；乙腈=6733；柱温室温；流速1 mL/min；检测波长350 nm；进样量20 L.1.2.2.2血浆样品处理5-6精取血浆样品0.5 mL, 置于1.5 mL离心管中, 加6%高氯酸0.5 mL沉淀蛋白, 漩涡混合0.5 min, 17209 g离心15 min, 取上清液20 L进样.1.2.2.3方法的专属性 取空白血浆, 空白血浆加对照品及样品血浆各1.0 mL, 按“1.2.2.2”项下操作, 进样20 L, 结果表明, 空白血浆中杂质不干扰盐酸米诺环素的测定

7、.               A：空白血浆； B：添加盐酸米诺环素标准品血浆； C：受试者血样.图1反相高效液相色谱法测定盐酸米诺环素色谱（略）1.2.2.4标准曲线与线性范围取空白血浆分别加入适量对照品溶液,使血浆中盐酸米诺环素浓度分别为0.207, 0.517, 1.034, 2.068, 3.102, 4.653 ，6.204  mg/L,按“1.2.2.2”项下处理, 测定对照品峰面积.以盐酸米诺环素浓度C（mg/L）对色谱峰面积（A）作线性回归

8、, 线性方程为A=14560 C+38.5(r=0.9999), 线性范围为0.2076.204 mg/L.1.2.2.5提取回收率分别配制低、中、高3个浓度（0.517, 2.068，4.653 mg/L）的对照品溶液和盐酸米诺环素血浆样品（血样按“1.2.2.2”项下处理）, 进样20 L, 测得提取回收率分别为（90.16±2.28）%, （95.07±3.53）%, （96.18±3.32）%；相对标准偏差（RSD）分别为2.53%, 3.71%, 3.45%.1.2.2.6相对回收率取空白血浆配制低、中、高3个浓度（0.517，2.068，4.653 m

9、g/L）的盐酸米诺环素血浆样品, 按“1.2.2.2”项下处理, 测定6次, 由随行标准曲线计算测得浓度, 计算方法回收率依次为（102.32±1.99）%,（95.95±1.81）%和（98.48±1.70）%.1.2.2.7血浆中盐酸米诺环素方法精密度将低、中、高3个浓度（0.517, 2.068, 4.653 mg/L）的血浆样品, 在1 d内按 “1.2.2.2”项下处理, 重复测定5次, 求得日内RSD分别为2.02%, 3.24%和2.57%. 将上述3个浓度的样品在3 d内连续各重复测定5次, 求得日间RSD分别为4.44%, 3.47%和2.71%

10、.         1.2.2.8稳定性试验7将低、中、高（0.517, 2.068, 4.653 mg/L）3个浓度的盐酸米诺环素血浆样品处理后分别置于常温下2, 4, 8, 16和24 h, 按前述方法测定盐酸米诺环素血浆浓度变化.计算样品稳定性, 求得室温稳定性RSD分别为3.79%, 1.64%和1.71%.将低、中、高（0.517, 2.068,4.653 mg/L）3个浓度的盐酸米诺环素血浆样品反复冻融6次并分别测定每次复融后浓度, 计算冻融对样品稳定性的影响, 求得冻溶稳定性RSD分别为1.57%,

11、1.44%和1.13%.统计学处理7-8: 以非房室模型估算受试者的主要药代动力学参数, Cmax和Tmax采用实测值, 药时曲线下面积(AUC)用梯形法计算. 所得参数先进行自然对数转换后再进行方差分析和双单侧t检验, Tmax采用非参数法检验(Wilcoxon 符号秩检验) 进行统计, 以=0.05为检验水准.2结果2.1药时曲线20名健康受试者交叉单剂量口服盐酸米诺环素片后的平均血药浓度时间曲线见图2.2.2主要药动学参数和相对生物利用度20名受试者口服米诺环素片和米诺环素胶囊后主要药动学参数见表1.对AUC(060 h)和Cmax作对数转换后先经方差分析, 两制剂在药物制剂间、个体间、

12、周期间和服药顺序间无统计学意义（P0.05）, 经双单侧t检验, 两种制剂的主要药动学参数差异无统计学意义（P0.05）, Tmax经非参数法检验(Wilcoxon 符号秩检验)差异无统计学意义（P0.05）, 表明两种制剂具有生物等效性.图2健康受试者交叉单剂量口服盐酸米诺环素后的平均血药浓度时间曲线(n=20)（略）表1健康受试者单剂量200 mg米诺环素的主要药动学参数（略）3讨论本试验考察了不同实验条件下, 被检测物质对流动相的选择性. 在查阅国内外文献的基础上, 根据盐酸米诺环素对pH值敏感性, 流动相中引入了高氯酸, 但米诺环素的峰严重拖尾, 为了减少拖尾, 改善峰形, 流动相中又

13、加入10 g/L三乙胺; 中国药典（2005版）规定检测波长为280 nm, 但在该检测波长下, 有与米诺环素不可分离的杂质干扰,为排除杂质干扰, 考虑其他检测波长, 确定最终色谱条件：色谱柱为菲罗门公司 C8柱（250 mm×4.6 mm, 5 m）；流动相为10 g/L三乙胺水溶液（高氯酸酸调节pH至2.05）; 乙腈=6733；柱温室温；流速1 mL/min；检测波长350 nm；进样量20 L. 本文所建立的高效液相色谱法灵敏, 准确性好, 保留时间短, 精密度高, 可满足米诺环素临床血药浓度检测和药动学研究的需要.米诺环素的不良反应有消化道反应、肝损害、肾损害、过敏、色素沉

14、着、影响骨发育和牙齿发育、激发反应等. 本试验过程中, 未发现有不良反应发生, 但不排除个体差异, 在临床用药过程中, 应重视药物的不良反应, 对发育期青少年应慎用.本试验应用双周期交叉自身对照实验设计方案, 对米诺环素片受试品和米诺环素胶囊参比制剂进行了人体生物等效性评价, 分别对主要药动学参数AUC, Cmax, Tmax采用方差分析、单双侧配对检验及90%置信区间三种方法进行等效性统计学处理, 结论为受试品与参比品的各主要药动学参数间均无统计学差异, 受试制剂米诺环素片对参比制剂米诺环素胶囊的相对生物利用度为111.5%, 两种米诺环素制剂在人体内具有生物等效性.【参考文献】 

15、 1 陈新谦, 金有豫, 汤 光新编药物学M16版北京：人民卫生出版社, 2007：83.2 Wrightson WR, Myers SR, Galandiuk S, et al. Analysis of minocycline by highperformance liquid chromatography in tissue and serumJ. J Chromatogr B Biomed Sci Appl, 1998, 706(2): 358-361.3 Mascher HJ. Determination of minocycline in human plasma by high p

16、erformance liquid chromatography with UV detection after liquidliquid extractionJ. J Chromatogr A, 1998, 812（1-2): 339-342. 4 Skúlason S, Ingólfsson E, Kristmundsdóttir T. Development of a simple HPLC method for separation of doxycycline and its degradation productsJ. J Pharm Biomed Anal, 2003, 33(4): 667-672.5 Orti V, Audran M, Gibert P, et al. Highperformance liquid chromatographic assay for minocycline in human plasma and parotid salivaJ. J Chromatogr B Biomed Sci Appl, 2000, 738(2): 357-365. 6 Colovic M, Caccia S. Liquid chromatogr