第二章 酶的发酵生产

1、第第2章章 酶的发酵生产酶的发酵生产 2.1 酶生物合成的基本理论酶生物合成的基本理论 2.2 发酵工艺条件及控制发酵工艺条件及控制 2.3 酶发酵动力学酶发酵动力学 2.4 动植物细胞培养生产酶动植物细胞培养生产酶2.1 酶生物合成的基本理论酶生物合成的基本理论 2.1.1 RNA的生物合成的生物合成转录转录 2.1.2 蛋白质的生物合成蛋白质的生物合成翻译翻译 2.1.3 酶生物合成的调节酶生物合成的调节一、一、RNA的生物合成的生物合成转录转录 转录是以转录是以DNA为模板，以核苷三磷酸为为模板，以核苷三磷酸为底物，在底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用聚合酶（转录酶）的作用下，生成下，

2、生成RNA的过程。的过程。二、蛋白质的生物合成二、蛋白质的生物合成翻译翻译翻译：以翻译：以mRNAmRNA为模板，以氨基酸为底物，为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种在核糖体上通过各种tRNAtRNA，酶和辅助因酶和辅助因子的作用，合成多肽的过程。子的作用，合成多肽的过程。四个阶段四个阶段1 1、氨基酸活化生成氨酰、氨基酸活化生成氨酰tRNAtRNA2 2、肽链合成的起始肽链合成的起始3 3、肽链的延伸、肽链的延伸4 4、肽链合成的终止、肽链合成的终止肽链的终止，释放和修饰肽链的终止，释放和修饰 终止密码子终止密码子 释放因子释放因子 肽链的修饰肽链的修饰操纵子模型（操纵子模型（oper

3、on model)：是原核生物基是原核生物基因表达的调节机制。大肠杆菌乳糖操纵子是第一个因表达的调节机制。大肠杆菌乳糖操纵子是第一个被子发现的操纵子（被子发现的操纵子（Monod和和Jacob，1961）操纵子及调节基因示意图操纵子及调节基因示意图酶合成调节的类型：酶合成调节的类型：诱导和阻遏诱导和阻遏1、酶合成的诱导、酶合成的诱导乳糖诱导乳糖诱导-半乳糖苷酶的合成半乳糖苷酶的合成淀粉诱导淀粉诱导a-淀粉酶的合成淀粉酶的合成E.coliE.coli能利用乳糖作为碳源，而利用乳糖作为碳能利用乳糖作为碳源，而利用乳糖作为碳源的酶只有当乳糖成为唯一碳源时才被合成。源的酶只有当乳糖成为唯一碳源时才被合

4、成。l乳糖操纵子由三个结构基因（乳糖操纵子由三个结构基因（lacZ lacZ 、 lacY lacY和和 lacAlacA）、）、操纵基因操纵基因O Olaclac、启动基因启动基因P Placlac、和调节和调节基因基因lacIlacI所组成（图）所组成（图）llacZlacZ，编码编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶llacYlacY，编码编码 - -半乳糖苷透性酶半乳糖苷透性酶llacAlacA，编码硫代半乳糖苷乙酰转移酶编码硫代半乳糖苷乙酰转移酶lO Olaclac ，它位于启动子它位于启动子55端的端的-5-5至至+21+21之间。该位之间。该位点可被乳糖阻抑蛋白相结合。点可被乳糖阻抑蛋白相结

5、合。llacI lacI ，它是一个独立的调节基因，编码乳糖阻它是一个独立的调节基因，编码乳糖阻抑蛋白。抑蛋白。2、酶合成的阻遏、酶合成的阻遏 （1）酶合成的反馈阻遏作用（末端代谢）酶合成的反馈阻遏作用（末端代谢物阻遏、产物阻遏作用）物阻遏、产物阻遏作用） 酶催化作用的产物或代谢物途径的末端酶催化作用的产物或代谢物途径的末端产物使该酶的生物合成受阻。引起反馈产物使该酶的生物合成受阻。引起反馈阻遏的物质，称为共阻遏物（辅阻遏阻遏的物质，称为共阻遏物（辅阻遏物）。物）。 组氨酸对组氨酸合成途径中的组氨酸对组氨酸合成途径中的10种酶的种酶的生物合成均起反馈作用生物合成均起反馈作用终产物终产物TrpT

6、rp对色氨酸操纵子的调节对色氨酸操纵子的调节3、分解代谢物阻遏作用、分解代谢物阻遏作用葡萄糖效应葡萄糖效应葡萄糖阻遏葡萄糖阻遏-半乳糖苷酶的生物合成；半乳糖苷酶的生物合成；o当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长时，通常优先利用葡萄糖，而不利用乳糖。时，通常优先利用葡萄糖，而不利用乳糖。只有当葡萄糖耗净后，细菌经过一段停滞期，只有当葡萄糖耗净后，细菌经过一段停滞期，不久在乳糖的诱导下不久在乳糖的诱导下-半乳糖苷酶开始合半乳糖苷酶开始合成，细菌才能充分利用乳糖。这种现象过去成，细菌才能充分利用乳糖。这种现象过去称为葡萄糖效应。后来了解到这是由于葡萄称为葡萄糖

7、效应。后来了解到这是由于葡萄糖降解物引起的，因此又称为降解物阻遏糖降解物引起的，因此又称为降解物阻遏（catabolite repressioncatabolite repression）。）。受降解物阻受降解物阻遏的酶类包括代谢乳糖、半乳糖、阿拉伯糖、遏的酶类包括代谢乳糖、半乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖等的操纵子。麦芽糖等的操纵子。lac 操纵子的正调控操纵子的正调控分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏CAP-降解物基因活化蛋白降解物基因活化蛋白分解代谢物激活蛋白，分解代谢物激活蛋白，cAMP受体蛋白受体蛋白细菌中细菌中cAMPcAMP的含量与葡萄糖的分解代谢有关。的含量与葡萄糖的分解代谢有关。当细菌利用

8、葡萄糖为能源时，当细菌利用葡萄糖为能源时，cAMPcAMP生成少而生成少而分解多，分解多， cAMPcAMP含量低；当环境中无葡萄糖可含量低；当环境中无葡萄糖可利用时，利用时， cAMPcAMP含量就升高。细菌细胞中含有含量就升高。细菌细胞中含有一种能与一种能与cAMPcAMP特异结合的特异结合的cAMPcAMP受体蛋白受体蛋白CRPCRP（cyclic AMP receptor proteincyclic AMP receptor protein，CRPCRP）。）。CRPCRP未与未与cAMPcAMP结合时是无活性的。当结合时是无活性的。当cAMPcAMP浓度浓度升高，与升高，与CRPCR

9、P结合并发生空间构象的变化而活结合并发生空间构象的变化而活化，化， cAMPcAMP与与CRPCRP结合生成的复合物即为结合生成的复合物即为CAPCAP。以二聚体的方式与特定的以二聚体的方式与特定的DNADNA序列结合序列结合。第二节第二节 发酵工艺条件及控制发酵工艺条件及控制工艺流程工艺流程保藏细胞保藏细胞细胞活化细胞活化细胞扩大培养细胞扩大培养发酵发酵分离纯化分离纯化酶酶原生质体原生质体固定化原生质体固定化原生质体培养基培养基无菌空气无菌空气固定化细胞固定化细胞预培养预培养一、细胞活化与扩大培养一、细胞活化与扩大培养活化：活化：使用以前，必须接种于新鲜的斜面培使用以前，必须接种于新鲜的斜面

10、培养基上，在一定条件下进行培养，以恢复养基上，在一定条件下进行培养，以恢复细胞的生命活动能力。细胞的生命活动能力。扩大培养：扩大培养：增加发酵时的数量，经过一级至增加发酵时的数量，经过一级至数级扩大培养。培养基称为种子培养基。数级扩大培养。培养基称为种子培养基。二、培养基的配制二、培养基的配制培养基：培养基：培养基的营养成分培养基的营养成分（1）碳源）碳源（2）氮源）氮源（3）无机盐）无机盐（4）生长因素）生长因素三、发酵条件的控制三、发酵条件的控制1、pH值调节：值调节：2、温度调节：、温度调节：热水升温、冷水降温热水升温、冷水降温3、溶解氧的调节控制：、溶解氧的调节控制：提高溶氧速率：通气

11、量、氧的分压、气液提高溶氧速率：通气量、氧的分压、气液接触时间和面积，培养液的性质。接触时间和面积，培养液的性质。四、提高酶产量的方法四、提高酶产量的方法 酶合成的调节机制：在正常情况下，酶酶合成的调节机制：在正常情况下，酶产量受酶合成调节机制的控制，要提高酶产产量受酶合成调节机制的控制，要提高酶产量必须打破这种调节控制。酶合成主要取决量必须打破这种调节控制。酶合成主要取决于转录水平的调节，原核生物中普遍公认的于转录水平的调节，原核生物中普遍公认的调节机制是操纵子理论。调节机制是操纵子理论。打破酶合成调节限制的方法：打破酶合成调节限制的方法：一、通过条件控制提高酶产量：一、通过条件控制提高酶产

12、量：1. 添加诱导物添加诱导物（1）酶作用的底物酶作用的底物（2）酶作用底物的前体物质酶作用底物的前体物质（3）酶的反应产物）酶的反应产物（4）酶的底物类似物或底物的修饰物）酶的底物类似物或底物的修饰物2. 降低阻遏物浓度降低阻遏物浓度3. 添加表面活性剂，促进分泌添加表面活性剂，促进分泌4. 添加产酶促进剂添加产酶促进剂二、通过基因突变提高酶产量：二、通过基因突变提高酶产量：使诱导型变为组成型，使阻遏型变为去阻遏型使诱导型变为组成型，使阻遏型变为去阻遏型第四节第四节 酶发酵动力学酶发酵动力学 发酵动力学：发酵动力学：主要研究在发酵过程中细胞生长速主要研究在发酵过程中细胞生长速率，产物形成速率

13、、基质消耗速率以及环境因素率，产物形成速率、基质消耗速率以及环境因素对速率的影响；在酶的发酵生产中，研究酶发酵对速率的影响；在酶的发酵生产中，研究酶发酵动力学对于了解酶生物合成模式，发酵条件的优动力学对于了解酶生物合成模式，发酵条件的优化控制，提高酶产量具有重要的理论指导意义。化控制，提高酶产量具有重要的理论指导意义。 酶生物合成模式：酶生物合成模式：根据酶的合成与细胞生长的关根据酶的合成与细胞生长的关系，可以把酶生物合成模式分为系，可以把酶生物合成模式分为4种类型：同步合种类型：同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。Continue 4同步

14、合成型同步合成型 ： 又称生长偶联型又称生长偶联型, ,是指酶合成与细胞是指酶合成与细胞生长同步进行，当细胞生长进入对数期时，酶也大生长同步进行，当细胞生长进入对数期时，酶也大量合成；当细胞进入稳定期时量合成；当细胞进入稳定期时, ,酶的合成也停止。酶的合成也停止。4延续合成型：延续合成型： 酶的合成伴随着细胞生长而开始，但酶的合成伴随着细胞生长而开始，但在细胞生长进入稳定期后在细胞生长进入稳定期后, ,酶的合成仍将延续较长一酶的合成仍将延续较长一段时间。段时间。4中期合成型：中期合成型： 酶的合成在细胞生长一段时间后才开酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入稳定期后始，而在细胞

15、生长进入稳定期后, ,酶的合成也终止。酶的合成也终止。4滞后合成型：滞后合成型： 只有当细胞生长进入稳定期后才开始只有当细胞生长进入稳定期后才开始酶的合成并大量积累酶的合成并大量积累( (图图2-1)2-1)。浓度浓度时间时间(h)细胞浓度酶浓度细胞浓度酶浓度酶浓度酶浓度细胞浓度细胞浓度图图2-1 酶生物合成模式酶生物合成模式 A.同步合成型同步合成型; B.延续合成型延续合成型; C.中期合成型中期合成型; D.滞后合成型滞后合成型ABCD影响酶生物合成模式的因素主要是影响酶生物合成模式的因素主要是mRNA和培养基和培养基中存在的阻遏物中存在的阻遏物： mRNA稳定性高的，可以在细胞稳定性高

16、的，可以在细胞停止生长后继续合成相应的酶；停止生长后继续合成相应的酶； mRNA稳定性差的，稳定性差的，随着细胞生长停止而终止酶的合成；随着细胞生长停止而终止酶的合成； 不受阻遏物阻不受阻遏物阻遏的遏的,可随着细胞生长而开始酶的合成；受阻遏物阻可随着细胞生长而开始酶的合成；受阻遏物阻遏的遏的,要在细胞生长一段时间或进入稳定期后解除阻要在细胞生长一段时间或进入稳定期后解除阻遏遏,才能开始酶的合成。才能开始酶的合成。 在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期期,最理想的酶合成模式是最理想的酶合成模式是延续合成型延续合成型；对于其它类；对于其它类型的

17、酶型的酶,要在菌种选育和工艺条件上加以调节；对于要在菌种选育和工艺条件上加以调节；对于同步合成型，尽量提高同步合成型，尽量提高mRNA的稳定性，如降低发的稳定性，如降低发酵温度酵温度;对于滞后合成型对于滞后合成型,尽量减少阻遏物；对于中期尽量减少阻遏物；对于中期合成型，要从合成型，要从提高提高mRNA稳定性稳定性和和解除阻遏解除阻遏两方面两方面进行。进行。 细胞生长动力学细胞生长动力学 4 细胞生长动力学主要研究细胞生长速率以及其受外界环境细胞生长动力学主要研究细胞生长速率以及其受外界环境因素影响的规律。因素影响的规律。1950年年Monod首次提一个动力学方程。首次提一个动力学方程。4 细胞

18、生长速率与细胞浓度呈正比：细胞生长速率与细胞浓度呈正比： 式中，式中， rx为细胞生长速率，为细胞生长速率，X为细胞浓度，为细胞浓度， 为比生长速率。为比生长速率。当培养基中只有一种限制性基质时，当培养基中只有一种限制性基质时， 为该限制性基质浓度的为该限制性基质浓度的函数：函数： 式中，式中，S为限制性基质浓度；为限制性基质浓度； m为最大比生长速率；为最大比生长速率；Ks 为为 Monod 常数。常数。 rx= dX/dt = X dX 1 m S = = dt X Ks + S4在连续发酵过程中，细胞生长动力学方程为：在连续发酵过程中，细胞生长动力学方程为： 式中，式中，D为稀释率，即单

19、位时间内流加的培养液与发为稀释率，即单位时间内流加的培养液与发酵液体积之比，单位为酵液体积之比，单位为1/h。D=0 时，分批发酵时，分批发酵； D 时，时，dx/dt 0, 发酵液中细胞浓度不断增加发酵液中细胞浓度不断增加 =D时，时， dx/dt = 0，细胞浓度保持恒定；细胞浓度保持恒定； D时，时， dx/dt 0，细胞浓度不断降低；细胞浓度不断降低； 但当但当D = m时，时，细胞浓度趋于细胞浓度趋于0，因此，必须控制，因此，必须控制适当的适当的D。dX mS X = - DX = ( - D)Xdt Ks + S 产酶动力学产酶动力学4产酶动力学主要研究细胞产酶速率以及各种因素对产

20、酶速率产酶动力学主要研究细胞产酶速率以及各种因素对产酶速率的影响。的影响。4宏观产酶动力学是研究群体细胞的产酶速率，又称非结构动宏观产酶动力学是研究群体细胞的产酶速率，又称非结构动力学；微观产酶动力学是研究个体细胞内的产酶速率，又称力学；微观产酶动力学是研究个体细胞内的产酶速率，又称结构动力学。结构动力学。4宏观产酶动力学与细胞比生长速率，细胞浓度以及产酶模式宏观产酶动力学与细胞比生长速率，细胞浓度以及产酶模式有关：有关： 式中，式中， 为与生长偶联的产酶比系数（为与生长偶联的产酶比系数（IU/g），）， 为非生长偶为非生长偶联的比产酶速率联的比产酶速率(IU/gh)，E为发酵液中酶浓度（为发

21、酵液中酶浓度（IU/L）。）。dE = ( + )Xdt 产酶模式不同，产酶速率与细胞生长关系也不同：产酶模式不同，产酶速率与细胞生长关系也不同： 同步合成型酶，产酶速率与细胞生长同步，同步合成型酶，产酶速率与细胞生长同步， =0： 中期合成型酶，为特殊的生长偶联型，其产酶动力学与同步中期合成型酶，为特殊的生长偶联型，其产酶动力学与同步合成型相同；但在阻遏物存在时合成型相同；但在阻遏物存在时 =0，无酶的合成；解除阻，无酶的合成；解除阻遏后才有酶的合成。遏后才有酶的合成。 滞后合成型酶，为非生长偶联型，滞后合成型酶，为非生长偶联型， =0： 延续合成型酶，为部分生长偶联型：延续合成型酶，为部分

22、生长偶联型：dE = XdtdE = XdtdE = ( + )Xdt 基质消耗动力学基质消耗动力学4基质消耗动力学主要研究发酵过程中基质消耗速率以基质消耗动力学主要研究发酵过程中基质消耗速率以及各种因素对基质消耗速率的影响。及各种因素对基质消耗速率的影响。4发酵过程中的基质消耗速率：发酵过程中的基质消耗速率：-dS/dt 用于细胞生长的基质消耗速率：（用于细胞生长的基质消耗速率：（-dS/dt）G 用于产物生成的基质消耗速率用于产物生成的基质消耗速率（-dS/dt）P 用于维持细胞代谢的基质消耗速率：（用于维持细胞代谢的基质消耗速率：（-dS/dt）M第五节第五节 动植物细胞培养生产酶动植物

23、细胞培养生产酶 利用动植物细胞培养生产各种天然物质，是生物利用动植物细胞培养生产各种天然物质，是生物工程的一个新领域，工程的一个新领域，20世纪世纪80年代以来，利用植物年代以来，利用植物细胞培养生产的有用产物已达细胞培养生产的有用产物已达100多种，其中酶制剂多种，其中酶制剂有有10多种。包括糖苷酶多种。包括糖苷酶(胡萝卜细胞，胡萝卜细胞，1981)，过氧化，过氧化物酶物酶(甜菜细胞，甜菜细胞，1983；大豆细胞，；大豆细胞，1989)等。呈现出等。呈现出良好的发展前景良好的发展前景.一、动植物细胞的特点一、动植物细胞的特点: 1、体积比微生物大；、体积比微生物大； 2、对剪切力敏感；、对剪切力敏感； 3、生长和代谢速率低，生长倍增时间和发酵周期长；、生长和代谢速率低，生长倍增时间和发酵周期长； 4、动物细胞营养要求复杂；、动物细胞营养要求复杂； 5、发酵产物不同、发酵产物不同二、植物细胞培养和发酵二、植物细胞培养和发酵1、植物细胞发