常用分子生物学技术的原理及应用

1、目目 录录常用分子生物学技术常用分子生物学技术的原理及应用的原理及应用The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application目目 录录第第 一一 节节分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization & Blotting Technology目目 录录核酸分子杂交核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在在DNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNA单链分单链分子放在同一溶液中，或把子放在同一溶液中，或把DNA与与RNA放

2、在一起，放在一起，只要在只要在DNA或或RNA的单链分子之间有一定的的单链分子之间有一定的碱基碱基配对配对关系，就可以在不同的分子之间形成关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双杂化双链链(heteroduplex) 。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理目目 录录复性复性RNADNA目目 录录（一）印迹技术（一）印迹技术（二）探针技术（二）探针技术 探针探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的

3、核膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。酸分子存在。 目目 录录二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。（二）（二）RNA印迹技术印迹技术 (Northern blotting) 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 目目 录录 其他其他斑点印斑点印迹迹 (dot

4、blotting) 原位杂交原位杂交 (in situ hybridization)DNA点阵点阵 (DNA array) DNA芯片技术芯片技术 (DNA chip)目目 录录三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较分子杂交实验分子杂交实验目目 录录放放射射自自显显影影照照片片目目 录录目目 录录DNA点阵点阵目目 录录目目 录录第第 二二 节节 聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应Polymerase Chain Reaction5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理一、

5、基本工作原理目目 录录Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的的含量可以扩大含量可以扩大100万倍以上。万倍以上。目目 录录目目 录录n模板模板DNAn 特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2+ 二、二、PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分目目 录录三、三、PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C目目 录录（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分

6、析（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析四、四、PCR的主要用途的主要用途目目 录录三、几种重要的三、几种重要的PCR衍生技术衍生技术（一）反转录（一）反转录PCR技术技术（二）原位（二）原位PCR技术技术（三）实时（三）实时PCR技术技术实时实时PCRPCR技术原理技术原理目目 录录目目 录录第第 三三 节节 核核 酸酸 序序 列列 分分 析析Nucleic Acid Sequence Analysis目目 录录核酸序列分析的基本原理核酸序列分析的基本原理化学裂解法化学裂解法 (Maxam-Gillbert法法)DNA链的末端合成终止法链的末端合成终止法 (s

7、anger法法)目目 录录一、化学裂解法一、化学裂解法( (Maxam-Gillbert法法) )基本原理基本原理基于某些化学试剂可以使基于某些化学试剂可以使DNADNA链在链在1 1个或个或2 2个个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的的DNADNA片段，将这些片段经电泳分离。片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记分析前，用同位素标记DNADNA的的5 5 末端，经放

8、末端，经放射自显影即可在射自显影即可在X胶片上读出胶片上读出DNADNA链的序列。链的序列。目目 录录二、二、DNA链末端合成终止法链末端合成终止法目目 录录目目 录录目目 录录三、三、DNA自动测序自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小激光激发不同大小DNA片段上的荧光

9、分子使之发片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定依此确定DNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。 目目 录录DNA自动测序结果举例目目 录录目目 录录基基 因因 文文 库库Gene Library第第 四四 节节目目 录录基因组基因组DNA文库文库 (genomic DNA library)cDNA文库文库 (cDNA library) 基因文库基因文库 (gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列的克隆群体。序列的克隆群体。目目 录录基因组基因组DNA文库文库

10、目目 录录目目 录录第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例目目 录录疾病相关基因的克隆与鉴定疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of Disease Relative Genes第第 五五 节节目目 录录克隆疾病相关基因的策略克隆疾病相关基因的策略（一）功能性克隆（一）功能性克隆( (functional cloning) )（二）定位克隆（二）定位克隆(positional cloning)（三）非定位候选基因克隆策略（三）非定位候选基因克隆策略(position- independent candidate ge

11、ne approaches)（四）定位候选基因克隆策略（四）定位候选基因克隆策略(positional candidate gene approaches )目目 录录定义定义 从对一种致病基因的功能的了解出发，从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。克隆该致病基因。（一）功能性克隆（一）功能性克隆应用应用 生化机制已明确、基因表达产物较易得生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。到部分纯化的遗传性疾病。目目 录录克隆方式克隆方式 利用特异性抗体筛选表达型利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库；文库； 根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作根据已知的部分氨基酸序列合成

12、寡核苷酸作探针，筛选探针，筛选cDNA文库。文库。 功能互补试验功能互补试验 (functional complementation assay)利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。 目目 录录（二）定位克隆（二）定位克隆定义定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。缩小范围，最后克隆该基因。系统的定位克隆工作系统的定位克隆工作 遗传学分析遗传学分析( (确定致病基因染色体定位确定致病基因染色体定位) )交换分析、连锁不平衡分析交换分析、连锁不平衡分析 分子生物学分析分子生物学分析染色体异常染色体异

13、常( (缺失、易位等缺失、易位等) )分析、基分析、基因文库的筛选与基因克隆因文库的筛选与基因克隆目目 录录（三）非定位候选基因克隆策略（三）非定位候选基因克隆策略 由于基因组作图的完成和分子病理学的由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。预测出候选致病基因。目目 录录（四）定位候选基因克隆策略（四）定位候选基因克隆策略当致病基因的染色体定位确认后，当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站人们可以利用因特网

14、上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。致病基因。目目 录录第第 六六 节节遗传修饰动物模型的建立遗传修饰动物模型的建立及应用及应用The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model 目目 录录转基因技术转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。入动物子宫，使之发育成个体。 转基因转基因被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物转基因动物(

15、 (transgenic animal)目的基因的受体动物目的基因的受体动物一、转基因技术一、转基因技术目目 录录核转移技术核转移技术 即即动物整体克隆技术动物整体克隆技术，将动物，将动物体细胞核全部导入另一个体的去体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆体，即克隆( (clone)。 二、核转移技术二、核转移技术目目 录录目目 录录基因剔除技术基因剔除技术也称也称基因靶向基因靶向( (gene targeting) )灭灭活，有目的去除动物体内某种基因活，有目的去除动物体内某种基因的技术。的技术。三、基因剔除技术三、基因剔除技术目目 录录

16、四、基因转移和基因剔除技术在四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用医学中的应用建立动物模型建立动物模型 单基因决定疾病模型单基因决定疾病模型 基因剔除基因剔除获得性突变获得性突变(gain-of-function mutation) 多基因决定疾病模型多基因决定疾病模型目目 录录第第 七七 节节 生生 物物 芯芯 片片 技技 术术Biological Chip Technology目目 录录DNA芯片芯片(DNA chip) cDNA芯片芯片(cDNA chip)是指将许多特定的是指将许多特定的DNA片段或片段或cDNA片片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位段作为探针，有规律地紧密排列固

17、定于单位面积的支持物上面积的支持物上 。一、基因芯片一、基因芯片(gene chip)目目 录录目目 录录目目 录录是将高度密集排列的蛋白分子作为探针是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)目目 录录第第 八八 节节蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用研究技术Research Techno

18、logy of Interaction of Protein目目 录录蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNADNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。的相互作用。 蛋白质之间相互作用研究的重要性蛋白质之间相互作用研究的重要性目目 录录酵母双杂交酵母双杂交各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）各种亲和分析（亲和色谱、