小胶质细胞人补体攻膜复合物亚溶破模型制作及功能鉴定

1、小胶质细胞人补体攻膜复合物亚溶破模型制作及功能鉴定作者：罗娜，白云，周静然，宋敏，王艳艳，杨晓亚，许雪青，段文元，熊加祥【关键词】 C56Preparati on and functional ide ntificati on of sublytic pleme ntmembra ne attack plex on cultured mouse microglia cells【Abstract 】AIM: To establish sublytic membra neattack plex (sMAC) models and ide ntify the sublytic effects on

2、mouse microglia cells in vitro. METHODS: An activated plex of C56 was gen erated by treatme nt of acute phase serum and C7-C9 came from fresh no rmal huma n serum to assemble sMACon cultured microglia cells in vitro. The sublytic dose of sMACwas determined by CCK8assay. SMACeposition was identifiedb

3、y lasercon focal microscope (LSCM). The activity of castoff cells and the cha nge of cell focal adhesion were determined by castoff counting and Trypan blue sta ining assay. ELISA was used to detect the cha nge of NO and TNFasecretion by sMAC. RESULTS: The sublytic dose of MAC was determi ned as C56

4、 1 : 480 and NHS 1 : 20. SMAC deposition on microglia cells was see n un der a LSCM; The nu mber of castoff microglia cells which had no rmal cell abilities was greatly in creased by sMAC pared tocontrols (P 95% 方满足实验要求.补体优球蛋白C56的提取及活性鉴定急性期患者血清与4 g/L酵母多糖，mmol/L Mg2+37C作用1 h后离心，取血清用微量补体反应性溶血法鉴定补体 C56

5、活性，收集活性样品用 mol/L PB(pH )透析，所得优球蛋白沉淀溶于含100 g/L甘油的mol/L PBS (pH ) 中，即为功能纯C56制品.比色实验确定sMAC亚溶破剂量将小胶质细胞以 2X108 /(L ?孔)接种于 96孔培养板，漂洗后，每孔中加入含 1 mmol/L EDTA无血清IMDM养基100卩L, 不同释度功能纯C56 10卩L，37C孵育15 min，再加入1 : 20 NHS 37C孵 育1 h组装sMAC.每孔中加入10卩L CCK8试剂，37 C 30 min,于450 nm波 长处测定A值.鉴定sMAC小胶质细胞上的沉积 将2X 104小胶质细胞接种于自制

6、盖玻 片小室，生长至80%融合，漂洗，加入亚溶破剂量 C56, 37C 15 min ;再加入 EDTANHS冰上孵育60 min于细胞表面组装sMAC.固定并封闭，加入小鼠抗人1 : 10 sMAC单克隆抗体，同时设立小鼠抗人 CD3 IgG同型对照和不加一抗阴性 对照，4 C过夜；FITC标记的羊抗小鼠二抗，4 C 1 h,漂洗后磷酸甘油封片， 4 C避光保存，48 h内用LSCM观察.刺激小胶质细胞后脱落细胞计数及细胞存活率细胞分为未刺激，sMAC同浓度C56, 1 : 20 EDTANHS失活sMAC共 5组. 将C56与NHS于 37C提前混合孵育 30 min，使sMAC失活.各组

7、细胞37C孵育24 h，收集温育液，离心，加少量 培养液重悬，以计数板计算脱落细胞数，同时以台盼蓝拒染法，计算细胞存活率.对小胶质细胞NO和TNFa合成的影响细胞分组同前，37C孵育12 h，收 集上清，离心后检测各组 NO与TNFa分泌量.统计学处理：应用SPSS软件处理，所有数据用x±s表示，组间采用t检验和方差分析，P1 : 480时,sMAC活性升高，小胶质细胞溶破增多；当 C56稀 释度1 : 480后，sMAC活性降低，小胶质细胞溶破减少故确立C56 1 : 480, NHS 1: 20为小胶质细胞亚溶破补体量.鉴定sMAC在小胶质细胞表面沉积以亚溶破剂量C56及 EDT

8、ANH体外组装sMAC LSCM观察可见细胞膜表面sMAC沉积明显（图1 ），同时小胶质细胞 膜完整性好，形态无明显变化，提示所加入的 sMAC是亚溶破剂量的sMAC.图1激光共聚焦显微镜鉴定sMAC组装LSCM X 200 （略）刺激小胶质细胞后脱落细胞计数及细胞存活率亚溶破剂量sMAC刺激细胞24 h后，细胞脱落增多（P）;台盼蓝染色见sMAC刺激后脱落细胞大多数为存 活细胞，其余对照组则大部分为死亡细胞（表 1 ）.由此推断，sMAC可降低细胞 黏附力，而不影响细胞活力.表1sMAC刺激小胶质细胞后脱落细胞计数及细胞存活率（略）aP vs未刺激组、C56单独组、EDTANH组和失活sMA

9、Cfi.亚溶破sMAC寸小胶质细胞NO和TNFa合成的影响5组小胶质细胞37C孵育12 h后ELISA检测上清中NO 与TNFa分泌量.SMACW激后小胶质细胞分泌NC与TNFa显著增高，同各对照 组相差显著（P，图2 ）.aP vs未刺激组、C56单独组、EDTANH组和失活sMACS.图2sMAC寸小胶质细胞分泌炎性因子 NO与TNFa的影响3讨论MAC乍为补体激活的终末因子，对不同细胞可产生不同效应，其对细胞的 杀伤功能主要取决于C9结合量，CD59分子可通过阻碍C9的聚集而调控MAC勺组装，是重要的补体膜调节蛋白3,同时，有核细胞可通过内吞等方式将 MAC 清除，防止细胞溶破补体在进化

10、过程中存在高度保守性，同种和异种间补体可 相互作用，产生不同的刺激效应如Adler等4以NHS和C56分子在大鼠肾 小球系膜细胞上组装sMAC,刺激细胞活化产生活性氧自由基；Halperin等5 证实人sMAC可促进小鼠3T3细胞细胞有丝分裂和再生增加.我们采用不同浓度 人补体C56与NH鋪C7C9成分体外确定了小鼠小胶质细胞 sMAC亚溶破剂量， LSCM佥证sMAC、胶质细胞的沉积，成功建立了小胶质细胞sMAC亚溶破模型，为后续功能实验奠定了基础.sMAC可促进单核/巨噬细胞脂质代谢增强，炎症介质和氧自由基大量释放， 早期可防御外侵、维持内环境稳定，而后期则对机体产生损伤.小胶质细胞是髓系

11、来源的CNS单核细胞，对神经系统炎症修复及免疫调节起重要作用.我们用sMAC刺激小胶质细胞后观察细胞脱落和活力改变，结果示sMAC能使细胞脱落增 加而活力不受影响，说明sMAC可降低小胶质细胞的黏附功能，其机制可能为改 变细胞外基质成分，对细胞骨架重排的结果6 .sMAC刺激小胶质细胞12 h后检测到细胞分泌炎性介质 NO和TNFa增加，其余对照组中，EDTA抑制补体 活化不产生MAC C56单独无炎性刺激效应；37E孵育下补体C7C9, S蛋白与 C56可直接结合形成失活sMAC不能与细胞结合，各组均无明显刺激效应.NO和TNFa是CNS炎性病变中重要的致炎因子，NO具有神经毒性，可导致 神

12、经元的损伤和死亡，TNFa能自分泌促进白细胞浸润，也可上调神经元MHC表达，更易受毒性T细胞攻击；并且TNFa的分泌可进一步诱导小胶质细胞 NFk B和PKC通路活化，释放NO花生四烯酸等介质促进炎性爆发7-8 .本 研究显示sMAC在 CNS炎症的早期阶段可能对小胶质细胞有炎性刺激效应，为今 后探讨补体在CNS炎性疾病中的发病机制提供了线索，但就其信号传导途径尚待 进一步研究.【参考文献】1 Cole DS, Morgan BP. Beyond lysis: Howplement influences cell fate J . Clin Sci, 20XX,104 (5):455-466.

13、2 Rus H, Cudrici C, Niculescu F. The Role of the ComplementSystem in Inn ate Immu nity J . Immu nol Res, 20XX,33(2):103-112.3 He C, Imai M, Song H, et al. Complement inhibitors targeted to the proximal tubule prevent injury in experimental nephrotic syndrome and demonstrate a key role for C5b9 J . J

14、 Immunol，20XX,174(9):5750-5757.4 Adler KS, Baker PJ. Johnson RJ, et al. Complementmembraneattack plex stimulates production of reactive oxygen metabolites by cultured ratmesa ngial cells J . J Clin In vest, 1986,77,762-767.5 Halperin JA,Taratuska A, NicholsonWeller A. Terminal pleme nt plex C5b9stimulates mitoge nesis in 3T3 cells J . J Cli n In vest , 1993,91,1974-1978.6 郭啸华，廖立生.补体攻膜复合体致肾小球