Real-timePCR技术介绍

1、基因的结构 基因和基因组 基因：是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列 一个典型的真核基因包括 编码序列外显子(exon)插入外显子之间的非编码序列内合子(intron)5-端和3-端非翻译区(UTR) 调控序列(可位于上述三种序列中)绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene)，外显子不连续。 基因组(genome )一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和。基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。人基因组3X1 09(30亿bp)，共编码约10万个基因。每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致(C-Value Paradox)。真核

2、生物基因组真核生物基因组的特点： 真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中。真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(23)。 基因诊断 基因诊断是通过检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。 基因诊断的主要技术：1、核酸分子杂交2、聚合酶链反应（PCR）3、基因芯片技术Real-time qPCR和常规PCR的区别 实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测 敏感性高 需要样品少 特异性高 精确定量 Real-time PCR概述实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，该技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧

3、光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 该技术在常规PCR基础上运用荧光能量传递(fluorescence resonance energy transfer，FRET)技术，加入荧光标记探针，巧妙地把核酸扩增(PCR)、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，借助于荧光信号来检测PCR产物。一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。聚合酶链反应（PCR）技术PCR的基本过程 PCR是一种体外扩增特异DNA片段的技术。它包

4、括下列三个基本步骤：1、变性（Denaturation）：待扩增的DNA模板加热变性成单链；2、退火（Annealing）：降低温度，使单链靶序列与寡核苷酸引物退火；3、延伸（Extension）：在适当条件下，利用DNA聚合酶使引物延伸，产生新的双链。上述变性、退火、延伸步骤的重复循环，导致特异的靶序列的指数扩增。 PCR产物是介于引物的5端之间的双链DNA片段。 Real-time PCR优点特异性更强；有效解决PCR污染问题（全封闭反应），自动化程度高； 灵敏度高； 重复性好，结果稳定可靠，同一标本的Ct值相同。Ct值(cycle threshold) Ct值的含义是：每个反应管内的荧光

5、信号到达设定的阈值时所经历的循环数 。荧光阈值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 SDcycle 3-15 。同一模板在96孔PCR仪上做的96次重复实验Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数， 纵坐标代Ct值。因此，只要 获得未知样品的Ct值，即可 从标准曲线上计算出该样品 的起始拷贝数。 荧光化学 荧光

6、染料法：非饱和染料SYBRGreenI法 饱和染料LC Green法 荧光探针法： 寡核苷酸探针：TaqMan探针法TaqMan-MGB探针法 杂技探针：Molecularbeacons（分子信标）FRET（双杂交探针 ）SYBR Green 染料法 DNA Target SequenceDenaturation Polymerization CompletePolymerizationSYBR Green 染料法定量的特点 方法简便，不需要设计探针； 成本低； 特异性低。荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDNA（如引物二聚体）结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的

7、问题目前可以用带有熔解曲线（melting curve）分析的软件加以解决。 饱和染料LC Green法 饱和染料LC Green法与SYBR染料法工作原理是一样的，但与传统的荧光染料 SYBR Green 相比有如下优点： LC Green 染料在进行PCR 时可以以饱和的浓度加入，不会抑制 PCR 反应，而Sybr Green 染料浓度过高会抑制 PCR 反应。从而，利用LC Green染料可以进行高分辨率熔解曲线分析。两类染料法的差异 在进行 HRM 分析时，由于饱和染料占据了 DNA 双链上每一对碱基上的空位，所以在双链解链时，染料立即与双链脱离，使得荧光信号发生较大的变化，而非饱和染

8、料常发生位置上的迁移，从而对荧光信号没有大的影响。除了LCGreen 染料外，常用的染料还有ResoLight、EverGreen等，这些都是绿色荧光染料，最佳激发波长范围440-470nm，发射荧光波长470-520nm。下图显示了饱和荧光染料 LCGreen 和非饱和荧光染料 Sybr Green 的区别 ：两类染料法的差异非饱和染料 Sybr Green 在 DNA 双链熔解时会发生位置的迁移，饱和染料 LCGreen 在 DNA 双链熔解时则直接从双链上脱落下来。 使用饱和染料 LC Green 得到的 DNA 双链熔解峰可以很明显的将杂合子给区分出来：TaqMan 探针法 该技术的原

9、理是利用Taq酶的53外切酶活性，在传统PCR技术一对特异性引物的基础上增加了一条荧光双标记探针。该探针可与上、下游引物之间的DNA模板序列特异性结合。探针的5端标以荧光报告基团，3端标以荧光淬灭基团。 在PCR退火复性期，探针与DNA模板特异性结合。 在PCR延伸阶段，Taq酶在引物的引导下，沿着模板合成新链，当移动至探针结合的位置时便发挥其53外切酶活性将探针降解成单核苷酸，使得荧光报告基团与淬灭基团分离，前者的荧光信号释放并被检测。因此，每合成一条新链就有一个探针被裂解并释放出一个荧光信号。荧光信号强度与PCR产物量相对应。TaqMan 探针法TaqMan -MGB探针TaqMan -M

10、GB探针 MGB探针的优点探针的优点：与传统的TaqMan探针比较，有以下优势： 1. 可以使探针的长度缩短，尤其对AT含量高的序列的MGB探针的设计有很大的帮助； 2. 提高配对与非配对模板间的Tm值差异； 由于在探针的3端的Quencher基团为不发光的荧光基团，并且与Report基团在空间的位置更接近，使杂交的稳定性大大提高，实验的结果更精确，分辨率更高，可以进行SNP分析。 3. 新探针实验优化步骤简单，杂交的重复性大大提高。Molecular beacons分子信标技术，其采用的探针在游离状态下呈茎环结构。环部的核苷酸序列与靶基因碱基序列互补，环两侧的茎部核苷酸序列互补而与靶基因序列

11、无同源性。其中环部通常含1535个碱基，而茎部长度为8个碱基左右。 探针的5端和3端分别标以荧光报告基团和淬灭基团，当探针游离时由于茎环结构的形成，两基团非常接近而形成荧光共振能量转移现象，报告基团的荧光信号被淬灭基团吸收。在PCR变性阶段该探针的茎部打开形成一条单链，当溶液中存在特异性模板时，在复性阶段该探针即可与模板杂交，使得5端和3端分离以至淬灭基团对报告基团失去抑制作用，后者的荧光信号得以释放，其荧光强度也与被扩增的模板量相对应。 由于酶切作用的存在，分子信标也是积累荧光 。Molecular beaconsFRET探针FRET探针又称双杂交探针，为罗氏发明专利。FRET 探针由两条相

12、邻探针组成，在一条探针的 5端标记 FAM （羧基荧光素）荧光基团，另一探针的3端标记 Red 640 荧光基团。当复性时，探针结合在模板上，FAM 基团和 Red640 基团相邻，激发 FAM 产生的荧光，作为 Red640 基团的激发光被吸收，使 Red640发出波长为 640 的荧光。当变性时，探针游离，两基团距离远，不能产生 640 波长的荧光。由于 FRET 探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号，非累积信号。常用的荧光基团是：LC-Red640，LC-Red705。荧光染料及探针比较荧光染料及探针比较 荧光染料及探针的简单总结与比较：荧光染料及探针的简单总结与比较：定量方法 标准曲

13、线法的绝对定量 标准曲线法的相对定量 比较Ct法的相对定量 标准曲线法的绝对定量 利用一系列稀释度不同的已知拷贝数的标准品制成标准曲线,根据待测样品的Ct值在标准曲线上找到相应的拷贝数。质粒DNA和体外转录的RNA常作为绝对定量标准品的制备之用。标准品的量可根据260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量来转换成其拷贝数来确定。 标准曲线法的相对定量由于在此方法中量的表达是相对于某个参照物的量而言的，因此相对定量的标准曲线就比较容易制备，对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样本的靶序列的量来自于标准曲线，最终必须除以参照物的量，即参照物是1*的样本，其它的样本为参照物量的n

14、倍。在实验中为了标准化加入反应体系的RNA或DNA的量，往往在反应中同时扩增一内源控制物，如在基因表达研究中，内源控制物常为一些管家基因（如-actin,3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH等）。 比较Ct法的相对定量 比较Ct法与标准曲线法的相对定量的不同之处于在于其运用了数学公式来计算相对量：平均相对含量平均相对含量=2-平均平均Ct 其中，其中， Ct=Ct待测待测-内源控制物内源控制物， Ct= Ct待测待测- Ct calibrator前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到Ct值来反应起始模板的量，一个循环（Ct=1）的不同相当于起始模板数2倍的差异。但是此方法是以

15、靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致为前提的，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计。protocol对靶基因进行Real-time PCR评价的过程： 选择检测方法（染料或探针）：根据具体实验的需要。 基础研究主要用SYBR Green； 探针比较特异，主要用于临床诊断。 设计引物与探针引物与探针的设计 选择基因的目标区域; 选择引物时，amplicon长度为100200bp。引物的Tm值必须比探针的Tm值低710，从而使探针与模板的结合早与引物，这对荧光的产生很关键。引物的最适Tm值是5560，长度为2025bp； 避免有二级结构。可用熔解曲线观察是否有引物二聚体； 探针的设计与引物相似； 最后

16、，用BLAST程序检查引物、探针与其他序列的同源性。反应体系2HotStart Mix 25l（包括Taq酶与酶的缓冲液） Primer A 0.10.5 M Primer B 0.10.5 M Probe或SYBR Green 0.10.5 M Mgcl2(25mM) 36 Mm 将以上试剂混合,再加入模板 Template DNA(50pg 500ng) 10l H2O 至50 lPCR体系中的主要成份 Taq DNA 聚合酶 是一种耐热的DNA聚合酶，具有5-3DNA聚合酶活性，一般有5-3外切酶活性，有或无3-5外切酶活性（校对活性），无校对活性的酶在PCR中错掺率较高。 PCR中 T

17、aq 酶的用量一般为0.5-2.5U，过多易造成非特异性扩增，过少可能灵敏度不够。两步法 Cyele numberDenaturationAnnealing/Extension14050215min,9530sec,95 30sec,60存在的问题Taqman技术中Taq酶的外切酶活性能影响定量Molecular beacons技术中探针与模板结合的稳定性还不理想。荧光定量PCR技术均存在探针标记的成本较高，不便普及的问题分析灵敏度仍需不断提高。PCR在基因诊断中的应用 （一）遗传病的基因诊断目前已有近百种遗传病可用PCR技术进行诊断和产前诊断。用PCR对遗传病进行诊断的前提是对致病基因的结构

18、必须部分或全部清楚。.如利用PCR-RFLP或Amp-FLP对遗传病家系进行连锁分析，进而作出基因诊断。（二）传染病诊断PCR已应用于多种病原体的特异性检测和鉴定1、病毒：如HBV，HCV，HIV，HPV等。2、致病菌：如淋球菌、结核杆菌、军团菌、幽门螺杆菌、肺炎支原体等；（三）肿瘤基因诊断1、原癌基因和抑癌基因突变，如ras,p53；癌基因扩增和表达分析。2、利用微卫星不稳定性，直接诊断肿瘤，如膀胱癌等；3、分析白血病（如CML）中异常染色体易位，检测微小残留病变（Minimal residual disease，MDR）4、肿瘤多药耐药性（multi-drug resistance,MDR）检测5、端粒酶活性检测。 常见Real-time PCR仪生产商荧光定量PCR仪型号需要特殊8连管与否（相较于Axygen 0.2ml八连管）StratageneMx3000P不需要Mx3005P不需要EppendorfMastercycler ep realplex4不需要ROCHELightCycler480是，需用原装96孔板或384孔板Bio-radCFX-960.1ml的8连管（矮管）。IQ5不需要ABIStep one/ Step one plus0.1ml的8连管（矮管）。ABI 7300/7