T-A克隆protocol

1、T-A克隆protocol一、实验原理通过PCR的方法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。1、DNA聚合酶：在PCR过程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分为2种情况：（1）大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物（双链DNA分子）的3末端添加一个A”的特性，如本实验常用的TaqDNApolymerase（自制和fermentas公司生产），在PCR扩增循环结束后，加上72C10分钟一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A,因此PCR产物回收纯化后可以和T载体直

2、接连接。（2）使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在扩增产物的3末端加上A,得到的DNA序列为钝端，因此，需要在回收纯化后进行加A的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的普通Taq酶和反应液，加入dATP或dNTP（东洋纺公司），72C10分钟，然后将加A产物直接用于TA连接。2、T-载体TA克隆系统都提供一个线性含3-T突出端的载体与含3-A突出端PCR产物连接。如pMD?18-TVector （takara公司） 、T-Essay （Promega公司） 等。 以实验室常用T载体pMD?18-TVector （takara公司）为例说明。pMD18-TVector是一

3、种高效克隆PCR产物（TACloning）的专用载体。它是TaKaRa独自研究开发，由pUC18载体改建而成的。 在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3端添加“T而成。pMD18-T是以最为常用的pUC18载体为基础研制而成， 所以它具有同pUC18载体完全相同白功能，如具有氨茉青霉素抗性基因及M13通用引物序列等。此外，试剂盒中的高效连接液LigationSolutionI可以在极短的时间内（30分钟-1小时）完成连接反应。另外，试剂盒中还含有ControlInsert（500bp）,可用于Contro

4、l反应。用途：克隆PCR产物。对克隆后的PCR产物用M13Primers进彳TDNA测序ME111ME111SMA347ISMA347IranranWEIIII舟EEEEI IsrisriEHRV V1-TC-lgrungSite1-TC-lgrungSiteI IXmaXmaI I3F3FS*CS*CI IFcroRIFcroRI3、连接外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌- -rr1 14atatTAg4atatTAginidleiA;inidleiA;r：流:渭;；DNA连接酶。实验室常用的连接酶是T4噬菌体DNA连接酶（ferm

5、entas公司），T4噬菌体DNA连接酶有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。在T4DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将线性的载体分子与外源DNA分子进行连接，形成环状DNA分子，这个过程称之为重组。TaKaRa提供的T-Vector试剂盒中的SolutionI是T4连接酶和T4连接酶buffer的混合液，可直接使用。也可以使用单独包装的T4连接酶和T4连接酶buffer。4、转化重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。所谓的感受态，即指受体（

6、或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70C保存（有效期6个月）。大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0C,CaCl2的低渗溶液中， 菌细胞膨胀成球形， 转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经

7、42c短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达， 在选择性培养基 （如氨芳青霉素抗性） 平板上， 可选出所需的转化子。5、重组子的鉴定T-Vector的多克隆位点两端具有通用的M13引物序列，通过PCR可鉴定外源DNA片段大小，若单克隆是阴性，其片段大小为载体本身的100bp,阳性则是外源片段大小加上载体本身的100bp。也可用外源片段本身的特异引物检测。、实验准备查看感受态是否还有火菌：1.5ml由 营心管一包，牙签一包，1ml,200ul,10ul枪头各一盒，液体固体液体LB一瓶，培养皿20个LB配

8、方Nacl蛋白脐酵母提取物琼脂粉LB（100ml）1g1g0.5g固体LB(100ml)1g1g0.5g1.5g配置50mg/ml或100mg/ml的氨牛青霉素，于-20C保存LB两瓶,三、实验步骤本实验室常做的T-A克隆一般有两种，一是直接从水平胶挖胶回收，二是从垂直板上挖胶回收，而从垂直板上回收的是单链DNA,需通过再次PCR扩增转化为双链，再通过水平胶挖胶回收，后面过程与水平胶一致。1、垂直板挖胶：将垂直板胶面朝外，选定所需回收的片段（一般回收4个点样孔的产物），用超纯水清洗胶块，润湿，用干净的解剖刀切割胶块。注意：切胶时应尽可能减少胶的体积，并保证产物的特异性。2、将胶块放入0.5ml

9、或1.5ml的离心管中，加入40-50ul超纯水（根据胶的体积确定），此时可打开水浴锅，将水煮沸，用200ul枪头将胶块捣碎，至用200ul枪可将碎胶吸至枪头中，5000rpm离心10-20秒，使胶和液体沉至管底，后置于沸水中水浴10分钟。3、将离心管放置冰上两分钟，5000rpm室温离心10-20秒，使液体沉至管底。此时单链DNA分子已溶于水中，溶液可直接作模板使用，若暂时不用，可于4c保存，长期保存于-20C中。4、用溶液作模板，特异引物配置PCR与常规PCR区别：引物溶液中DNA含量较低，模板为常规PCR的一倍，可相应减少PCR中超纯水量，其余条件一致。为保证回收产物的量，PCR-般扩增

10、40ul-60ul体系。注意：不要将碎胶吸入PCRE中。5、水平胶挖胶：为保证PCRT物的特异性，水平胶回收必须使用新胶，用1.0%的琼脂糖凝胶，150-170V电泳，15-30分钟（根据片段大小确定）后，于凝胶成像系统中保存图片，然后在紫外灯下回收含DNA勺琼脂块，放入1.5ml离心管中。注意：胶在紫外光下照射的时间应尽可能短，切胶时应尽可能减少胶的体积。6、DNA回收：一般使用琼脂糖凝胶回收试剂盒，本实验室常用的是上海生工的产品，产品中有详细的使用说明书。注意：因为胶回收量不会很多，为确保回收产物的浓度，一般只加30-35ul的洗脱液或超纯水洗脱，这是与说明书不一致的地方。7、回收产物检测

11、：做一块较薄的水平胶，点5ul检测回收产物中DNA含量，一般能看到带，即表明对后面步骤没有影响。8、连接：一般使用TaKaRapMD18-TVector,连接体系：载体0.5ul,SolutionI2.5ul,外源片段2ul如使用fermentas的T4DNA连接酶，则是载体0.5ul,外源片段2ul,T4DNA连接酶0.5ul,T4DNA连接酶buffer0.5ul,超纯水1.5ul。连接可于4c冰箱过夜，也可于16c连接2.5-3小时，或室温45分钟。于4c冰箱过夜中过夜效果最好，若片段较大，如1kb以上，建议4c冰箱过夜。9、转化（此步操作在超净工作台上完成）实验室使用的感受态一般是化学

12、法（CaCl2法），感受态为实验室自制，存放于-70C超低温冰箱中。转化时将感受态从冰箱中取出，放于冰上解冻，以连接产物：感受态=1:10的比例混合，即5ul连接产物加50ul感受态，冰上放置30分钟（让DNA充分粘附在细菌细胞膜上），然后42c热激60秒，迅速取出置于冰上，2分钟后加入300ul无抗生素的LB的培养基，在37c摇床中复苏1小时（让导入外源片段的细胞在没有选择压力的条件下生长）。10、单克隆培养（此步操作在超净工作台上完成）在菌液复苏好之前，要准备好培养单克隆的培养皿，将固体LB在微波炉中融化，然后冷却固体LB,当其冷却至50c左右，即装有固体LB的三角瓶不烫手时，按终浓度为5

13、0ug/ml的比例加入氨芳青霉素，混匀，倒入已灭菌的平皿中。取复苏后的菌液200ul,用涂棒将其均匀涂在已加有氨芳青霉素的平皿上，于37c恒温培养箱中培养12-14小时。注意：培养时间不能超过16小时，否则培养皿上容易长出微型菌落，污染单克隆。11、单克隆挑取在超净工作台中，在操作板上放置已灭菌的1.5ml离心管，加入300ul已加氨芳青霉素（终浓度为50ug/ml）的液体LB,用灭菌的牙签挑取单克隆，每个牙签挑一个单克隆，然后放置于已加LB的离心管中，盖上离心管盖，然后将其置于37c摇床中培养4-5小时。注意：牙签在培养皿上挑斑上只需轻轻沾在表面即可，不要用力过猛，戳破培养基，导致没有挑到菌

14、斑。每个外源片段挑6-12个单克隆，挑取多少于外源片段大小，载体连接效率有关，片段越大，连接效率越低，越需要多挑，如2K以上的片段，可能需要将所有的克隆全部挑取才能得到阳性克隆。12、菌液检测用培养好的菌液做模板， 在超净工作台汲取2ul于PCRS中， 将用M13通用引物或外源片段特异引物配好的mixture分装到PCR孔中，PCR体系与普通PC林系一样，M13通用引物的退火温度为56Co用水平胶或垂直板检测PCRT物，产物大小与外源片段一直的样品则是阳性的重组子，可用于后续的实验和测序。四、常见问题1、挑斑检测无阳性克隆可能原因：1、片段太大，导致PCR程中dNTP消耗完，无法完成最后加A过程，所以无法与T载体连接；2、洗脱液日utionBuffer被污染；3、回收试剂盒出问题，导致回收产物中有影响连接的成分。解决方法：1、将PCRf物回收后，再做一步加A的过程。加A体系：buffer:2ulMg2+：1.6ulTaqE:0.4uldATP（dNTP）:2ul回收产物：14ul加A后产物可直接用于连接，不用再次回收。2、用超纯水洗脱3、若回收试剂盒有问题，可以直接用酒精沉淀的方法回收PCRT物，而不通过回收柱。将PCR产物吸入1.5ml离心管中，按产物2.5倍体积加入无水乙醇，1/10体积NaAc（KAc）,混匀，-20C