谢建(ZnPP对种植性乳腺癌血管生成影响的实验研究)

1、·大会交流·ZnPP对种植性乳腺癌血管生成影响的实验研究谢建 杨渊 刘胜春 400016 重庆，重庆医科大学附属第一医院普外科 【摘要】目的 探讨锌原卟啉（ZnPP）对种植性乳腺癌VEGF和血管生成的影响。方法 应用种植性乳腺癌模型，经过ZnPP和钴原卟啉（CoPP）处理，检测乳腺癌组织中的血红素氧合酶1(HO-1)酶活性，免疫组化、Western blot蛋白印迹杂交检测癌组织中HO-1、VEGF蛋白表达，RT-PCR检测VEGFmRNA，CD34染色肿瘤微血管内皮细胞并对其进行定量分析。结果 ZnPP组肿瘤直径（7±1.06mm，n=7，）明显小于其余各组(t

2、=3.5334 ,P<0.001 )；CoPP组（13±2.82 mm，n=13，）大于空白对照组（10±1.63mm，n=8） (t=3.6564, P<0.002)。CoPP组VEGFmRNA (0.3046±0.0102)明显高于空白对照(0.1524±0.0046)及ZnPP组(0.1216±0.0043)（t=8.8491,P<0.001）。 ZnPP处理组HO-1及VEGF蛋白印迹杂交结果低于CoPP组和空白对照组（t=4.698,P<0.005）（t=5.5428,P<0.005）。ZnPP处理组ME

3、A为224.81±79.4266明显低于CoPP组448.79±138.46 (t=5.3426, P<0.05)。结论 ZnPP可能通过抑制HO-1蛋白的表达来降低VEGF表达，降低肿瘤血管生成，并可能由此降低了肿瘤细胞的增殖生长。【关键词】血红素氧合酶-1；乳腺肿瘤；血管内皮细胞生长因子；血管生成Experiment study of Effect of Zinc Protoporphyrin on angiogenesis in planted breast carcinoma XIE Jian,YANG Yuan,LIU Sheng-chun. Departm

4、ent of General Surgery, The First Affiliated Hospital, Chongqing University of Medical Science, Chongqing 400016,China【Abstract】Objective To investigate the effect of Zinc Protoporphyrin(ZnPP) on VEGF and angiogenesis in planted breast carcinoma. Methods The planted breast carcinoma was treated with

5、 ZnPP and Cobalt Protoporphyrin(CoPP), the Haem oxygenase-1(HO-1) protein and enzyme activity in carcinoma tissue were assessed by western blot and so on. At the same time VEGF were examined by RT-PCR, western blot and microvessel endothelial cell were stained by immunohistochemstery with CD34. Micr

6、ovessel Endothelial Area(MEA) were estated. Results The diameter of tumor in ZnPP group was significantly smaller than that in other groups (t=3.5334 ,P<0.001 ) and that in CoPP group was biggest(t=3.6564, P<0.002)。The VEGF mRNA in tumor of ZnPP group(0.1216±0.0043) were lower than those

7、in other groups, and which in CoPP group were highest(0.3046±0.0102)（t=8.8491,P<0.001）. The MEA in ZnPP group (224.81±79.4266) were lower than those in CoPP group(448.79±138.46）(t=5.3426, p<0.05). Conclusions ZnPP is likely to inhibit HO-1 protein expression to decrease expressi

8、on of VEGF mRNA and VEGF protein, consequently decrease the angiogenesis in the planted breast carcinoma. 【Key words】Haem oxygenase-1; Breast carcinoma; VEGF; Angiogenesis 血红素氧合酶-1(haem oxygenase-1, HO-1)，又称热休克蛋白32(heat shock protein 32, HSP32)是降解血红素为胆绿素、CO和Fe2+的起始酶和限速酶。近年研究发现HO-1对应激反应的细胞保护起重要作用，本组实

9、验拟通过ZnPP抑制HO-1在种植性乳腺癌细胞中的表达探讨ZnPP对种植性乳腺癌血管生成的影响。材料和方法1验对象：SHZ-88鼠源性乳腺癌细胞（由本院普外科实验室提供）培养在含10%的新鲜胎牛血清的RMPI1640培养液中，分别加入50u/ml的青霉素及50mg/ml的链霉素，预先37、 5% CO2 和100%相对湿度环境中培养，细胞进入对数生长期。2 试剂：ZnPPIX Zinc (Zn) protoporphyrin (PP) 美国Sigma-Aldrich公司产品。配制：将ZnPP溶于0.1M NaOH， pH7.4，终浓度为1mg/ml。CoPPIX Cobalt protopor

10、ohyrin (CoPP) 美国Sigma公司产品，由Professor Song Weihong (The University of British Columbia)惠赠。配制方法同ZnPP。3 细胞培养及处理: SHZ-88鼠源性乳腺癌细胞培养细胞进入对数生长期。后更换分别含有2uMCoPP和ZnPP细胞培养液继续培养48小时,对细胞进行HO-1原位免疫组化检测。 4 实验动物分组: 产后7天SD乳鼠18只，前胸壁常规消毒后皮下注射SHZ-88细胞悬液0.2ml/只（106/ml）。随母鼠喂养并自由摄水摄食。两周后随即分为三组：A组，空白对照组：不给予任何处理因素。B组，ZnPP组：按

11、1.5mg/Kg/D体重经腹腔注射ZnPP。C组，CoPP组：按5mg/Kg/D体重经腹腔注射CoPP。一周后处死幼鼠并立即切取肿瘤组织，将其一分为二，分别置-80保存和多聚甲醛固定，石蜡包埋。5 HE及免疫组化检测: 常规HE染色，免疫组化所用兔抗鼠HO-1、VEGF、CD34均购自武汉博士德公司采用SABC法染色，实验中设置阳性及阴性对照。血管计数CD34染色以血管内皮细胞染为棕黄色为阳性，采用真彩色图像分析仪(MD20型、德国LEICA)进行CIAS定量分析：在25.6×10倍镜下选择3着色密度最高区域对染色面积进行定量测定(除外血管腔8个红细胞或管壁可见平滑肌者)，并求出微血

12、管内皮细胞面积MEA.6 RT-PCR检测VEGFmRNA的表达 经典总RNA提取试剂盒（上海生工，SK1351）提取总RNA，按试剂盒操作说明合成第一条链。紫外分光光度计测定RNA浓度，琼脂糖电泳证实RNA的完整性。 VEGF的引物序列为：正义引物5'-TCGCIQCCTCCGAAACCATGA-3',反义引物5'-CCTGGTGAGAGATCTGGTTC-3',产物cDNA 262bp；-actin正义引物 5-GTAAAGACCACTTTGCCAACA-3 反义引物 3-CACCATCATCCTTCAGGGAG-5，产物长度214bp。PCR反应条件：预变

13、性942min，95变性1min，55退火40s，72延伸1min，共35个循环，最后72延伸5min。产物在质量浓度为1%的琼脂糖上电泳，利用Syngene系统进行图象分析，作ODHO-1/OD-actin光密度比值测定。6 HO-1的酶活性测定: 取100mg肿瘤组织按1:4加入0.1molKH2PO4 ,冰上匀浆，4下12,000×g离心20min后在将上清液在4下12,000×g离心60min。20l上清，50mmHemin，2mmG-6-P，G-6-P脱氢酶，0.25l 0.8mM NADPH，1.8ml 0.1ml KH2PO4，标准肝组织匀浆上清液20l，37

14、避光反应60min后冰上终止反应。以不含NADPH的样品作空白对照，464nm、530nm测定胆红素生成（胆红素的摩尔消光系数为40mmol/L.cm）。7 HO-1、VEGF蛋白印迹杂交: 4下在匀浆器中用0.5ml蛋白提取液提取0.1g肿瘤组织总蛋白，紫外分光光度计测定并调整总蛋白浓度为0.5mg/ml，10%SDS-PAGE电泳（电泳电压9V/cm，进入分离胶后增加为15V/cm）,电泳4小时后电转到硝酸纤维膜上（电流0.65mA/cm, 时间15小时）。5%脱脂奶粉PBST封闭1小时，加兔抗鼠HO-1 、VEGF多克隆抗体（1:200）过夜，羊抗兔二抗HRP（1:1000,Santa

15、Cruz,北京中山生物试剂公司分装）1小时，利用ECL试剂盒（SC-2048,Santa Cruz）化学发光法显色，胶片暴光3-5,扫描入计算机分析积光光密度。8 统计学处理: 实验结果中计量资料采用均数±标准差(D)表示，利用SPSS软件进行分析，组间比较采用t检验，以p<0.05为差异有显著性。结果1 HO-1在体外细胞中的表达：HO-1蛋白主要表达在肿瘤细胞胞浆及胞膜（见图1），其表达强度可以看出经过CoPP诱导出了HO-1在肿瘤细胞内表达。2 动物模型及肿瘤巨体检查: 所有幼鼠均有肿瘤形成，共生成肿瘤28个，ZnPP组肿瘤直径（7±1.06mm，n=7，）明显

16、低于其余各组(t=3.5334 ,P<0.001 )；CoPP组（13±2.82 mm，n=13，）大于空白对照组（10±1.63mm，n=8） (t=3.6564, P<0.002)。3 HE和免疫组化检测结果：HE染色检查经病理检查证实所有标本均为乳腺癌组织。HO-1蛋白主要表达在肿瘤细胞胞浆及胞膜（见图2a）。VEGF在肿瘤细胞浆及细胞核中均有表达(图2b)，CD34主要散在表达在肿瘤间质内的血管内皮细胞胞奖内(图2c)。CD34图象分析结果显示：空白对照组MEA为293.90±137.24（140.62518.69），与ZnPP处理组MEA为2

17、24.81±79.4266（65.5388323.73）没有显著差异（p>0.05），而CoPP组明显高于前两组448.79±138.46（164.66698.16）(p<0.05)4 VEGFmRNA RT-PCR检测结果：各实验组肿瘤组织均有VEGFmRNA表达见图3。CoPP组VEGFmRNA与-actin的RT-PCR结果OD比值(0.3046±0.0102)明显高于空白对照(0.1524±0.0046)及ZnPP组(0.1216±0.0043)（t=8.8491,P<0.001）。 HO-1、VEGF蛋白印迹杂交结果

18、：HO-1蛋白印迹杂交结果见ZnPP处理组细胞HO-1表达最弱，光密度比值明显低于CoPP组和空白对照组（t=4.698,P<0.005）。同样VEGF与HO-1的结果相似（t=5.5428,P<0.005）。表1 各组肿瘤组织HO-1,VEGF蛋白印迹杂交(积分光密度)结果() 分组 样本 HO-1 VEGF 空白对照 6 35.48±8.14 25.58±3.54 ZnPP组 6 20.98±6.60 19.67±6.69 CoPP组 6 55.64±10.10 39.32±7.43 6 HO-1的酶活性测定：HO-1

19、酶活性测定结果空白对照组1.435±0.2326nmol胆红素/mg蛋白质/1h，低于CoPP组1.765±0.2828nmol胆红素/mg蛋白质/1h（t=3.7937,P<0.002），但高于ZnPP组1.105±0.1114nmol胆红素/mg蛋白质/1h（t=3.816 P<0.005）。 讨论Yanagawa等1报道单因素分析HO-1低表达与头颈部肿瘤的未分化程度和淋巴结转移明显相关（P=0.04，P=0.01）。Caballero等2用免疫组化检测DAB诱导的肝脏癌前病变及肿瘤组织，发现HO-1在癌前病变及早期肿瘤表达较少，在肝细胞性肝癌中

20、HO-1的表达与肿瘤的分化程度成反相关，认为降低HO-1与肿瘤癌变过程有关。Fang等3用聚乙烯-乙二酯-糖结合ZnPPpoly(ethylene glycol)-conjugatedZnPP,PEG-ZnPP在体内实验有阻止HO-1活性及抗肿瘤作用；体外实验结果发现PEG-ZnPP诱发了氧化应激并导致SW480人结肠癌细胞凋亡。同时该作者报道ZnPP可提高肿瘤细胞对喜树碱、阿霉素等化疗药物的反应4.Berberat PO等5在胰腺肿瘤细胞实验中分别评估HO-1对化疗、放疗的影响，发现用SiRNA技术降低HO-1的表达能明显增加胰腺肿瘤细胞对吉西他宾和放射治疗的敏感性，认为特异性抑制HO-1的

21、表达可能是胰腺肿瘤的一个新的治疗选择，并可能是化疗、放疗效果增敏剂。我们曾经报道通过ZnPP降低肿瘤组织内的HO-1mRNA、HO-1蛋白及HO-1酶活性，并发现降低HO-1表达以后肿瘤细胞的STAT-3和抗凋亡基因Bcl-XL蛋白的表达降低，而增加了凋亡蛋白酶CAS-3的表达，并可能由此增加了肿瘤细胞凋亡的发生，抑制了肿瘤的生长6。对于HO-1对肿瘤血管生成的影响，目前为止研究报道不多，Sunamura M7等发现尽管增加体外细胞的HO-1表达没有显示出对细胞增殖发展的改变，在胰腺肿瘤裸鼠模型体内研究中发现，增加HO-1的表达使肿瘤细胞增殖加快，同时肿瘤的血管生成明显增加，并增加了肿瘤转移事

22、件的发生。认为HO-1通过增加血管内皮细胞的生存而刺激肿瘤的血管生成。 本实验中,我们用CoPP处理SHZ-88鼠源性乳腺癌细胞后,发现细胞中HO-1表达有增加。说明在体外实验中可以增加细胞的HO-1表达。我们在该细胞种植形成的乳腺癌体内模型中，发现HO-1mRNA水平，蛋白表达水平以及HO-1酶活性水平都显示可以用CoPP和ZnPP增加或抑制HO-1的表达水平和酶活性。同我们曾经报道的结果一致，ZnPP组肿瘤直径（7±1.06mm，n=7，）明显低于其余各组(t=3.5334 ,P<0.001 )；CoPP组（13±2.82 mm，n=13，）大于空白对照组（10&

23、#177;1.63mm，n=8） (t=3.6564, P<0.002)。为了解HO-1对肿瘤血管生成有无影响，我们检测了肿瘤组织中的VEGF的表达，同时用CD34标记肿瘤组织内的微小血管，并对微血管内皮细胞面积（MEA）其进行半定量分析，结果发现CoPP组VEGF蛋白表达水平（39.32±7.43）明显高于其余两组，而ZnPP组最低（19.67±6.69）。并且在微血管内皮细胞CD34染色，MEA定量检测得到同样的结论，CoPP组MEA448.79±138.46（164.66698.16）明显高于其余两组，而ZnPP处理组224.81±79.42

24、66（65.5388323.73）最低(p<0.05)。说明HO-1可能通过增加血管生成因子VEGF的表达，促进了肿瘤的新生血管形成，从而加快了肿瘤的生长。该结论对进一步研究通过抑制HO-1在肿瘤组织内的表达以抑制肿瘤内的血管生成，从而达到抑制肿瘤生长的治疗目的提供了可能，但其作用机理尚不甚清楚，还有待进一步深入研究。参考文献1 Yanagawa T, Omura K, Harada H, et al. Heme oxygenase-1 expression predicts cervical lymph node metastasis of tongue squamous cell c

25、arcinomasJ. Oral Oncol, 2004, 40:21-27.2 Caballero F, Meiss R, G imenez A, et al. Immunohistochemical analysis of heme oxygenase-1 in preneoplastic and neoplastic lesions during chemical hepatocarcinogenesisJ. Int J Exp Pathol,2004,85:213-222.3 Fang J, Sawa T, Akaike T, et al. In vivo antitumor activity of pegylated zinc protoporphyrin: targeted inhibition of heme oxygenase in solid tumorJ. Cancer Res, 2003,63:3567-3574. 4 Fang J, Sawa T, Akaike T, et al