透射电镜标本制备 - 北京大学基础医学院

1、透射电镜标本制备方法薄片（薄片（1000埃）埃）1 制备硬标本块儿后超薄切片（最常规）2 溶液成膜（颗粒1000埃： 细胞碎片，病毒，生物大分子）3 复型薄膜（在组织细胞表面或裂面喷上一层金属膜，将膜剥离后观察）11制备硬标本块后超薄切片 冰冻块切片： 简便，快，结构保存相对差，价格贵 树脂块切片 复杂，慢，结构保存较好，价格相对便宜树脂块的制备1 取材与固定取材与固定 目的目的 将所取样本尽可能固定在生活状态下 固定剂 戊二醛（醛基和氨基反应） 四氧化锇（锇与双键螯合） 多聚甲醛（醛基和氨基反应）HC醛基和氨基反应HCO+NH2HCN（西佛碱）（西佛碱）醛醇反应适合保存：蛋白质，核酸，多糖不

2、适合保存：脂类分子量较小，渗透较快固定效果：固定效果：戊二醛优于甲醛适合保存：脂类（蛋白质也可以）不适合保存：核酸，多糖分子量较大，渗透能力弱，均匀快速的固定局限于0.25mm(块0.5mm立方)长时间固定组织块易脆锇与双键反应多用双固定：戊二醛+四氧化锇(两步或一步)块不能太大1mm立方固定液=固定剂+缓冲液缓冲液：维持pH, 渗透压0.1M磷酸缓冲液（PB）固定剂浓度：戊二醛（GA）：3%（ 0.1M PB ）四氧化锇(锇酸):1% （ 0.1M PB ）多聚甲醛（FA）:4% （ 0.1M PB ）2.5%戊二醛+2%多聚甲醛（ 0.1M PB ）1%戊二醛+1%四氧化锇（ 0.08M

3、PB ）固定方法（迅速）： 原位固定原位固定 （一些不便于迅速摘取的组织） 灌流固定后取材灌流固定后取材（通过血液循环的途径将固定液引入到要固定的组织中，适用于离体后会变形变性的组织，例如肺泡，对缺氧比较敏感的脑组织等，注意选择最短的循环途径）取材后固定取材后固定 小小，冷冷， 快快 将动物麻醉或急性处死，暴露所需器官 剪取小块组织，放在预先冷冷却的固定液中 在洁净纸片上滴一滴冷冷却的固定液，取出组织块初步修块 （细长条：L：2-3mm,W：1mm） 转移回冷冷却的固定液中常规（两步固定法）常规（两步固定法） GA固定液中4C 12h(中间0.5-1h可取出修块) 转移到冲洗液中（0.18M蔗

4、糖in0.1MPB） 4C 12h(原则上与固定时间相等)，中间换液2次 锇酸固定液中4C或 R.T.1h dd水中冲洗 *在冲洗液中可存放12周，但每周至少换一次液（在固定液中长放易脆） *经GA固定后膜还有一定的渗透作用，在经锇酸固定后就没有了 *清洗要充分（GA与锇酸会产生微细沉淀，一般两个固定液间更换两次冲洗液后第三次过夜；锇酸与乙醇会产生微细沉淀）购买与存储2 脱水 目的去除样品中的水，为包埋剂（非水溶性）的均匀浸透做准备 脱水剂：乙醇或丙酮（梯度脱水）50%70%(80%)90%100%100%10-15m10-15m10-15m10-15m45m45m4C4C4C4C或 R.T.

5、R.T.R.T. *低浓度时对组织有提取作用，时间不可长 *低温可降低提取作用，但100%低温会吸水 *可停在90%过夜，不能在100%，脆 时常摇动 *100%加干燥剂保存在干燥器中3 浸透与包埋目的使包埋剂浸透样品后，固化成硬块包埋剂（几类物质的混合物） 环氧树脂（基本成分） 氨类物质（催化剂） 酸酐（交联）固化剂 临苯二甲酸二丁酯（增塑剂）包埋原理EPON 812包埋剂的基本要求脱水剂+包埋剂 1 ： 1 包埋剂包埋剂包埋剂 1h过夜1248h24h37C或 R.T.37C45C60C胶囊中胶囊中胶囊中*不要加盖*R.T.下干燥器中可保存相当长时间4 修块与切片0.1*0.1mm90度梯

6、形 玻璃刀（现做现用，20-30片） 钻石刀 切片机的工作原理： 金属膨胀杆 切片厚度与颜色500A 600-900A900-1500A1500-1900A1900-24002400-2800A灰色银灰色 金黄色 紫色蓝色绿色*环氧支持网与支持膜 铜网 不锈钢网 3mm 目数 镍网 金网 聚乙烯醇缩甲醛膜（Formvar）（0.2-0.5% in 氯仿） 聚乙烯醇缩丁醛膜 火棉胶膜（14in醋酸戊酯） 碳膜*切片保存5 染色目的将重金属原子结合到细胞结构上使造成图像反差重金属：铅盐（重金属：铅盐（Pb,82）蛋白质，糖元，脂类（膜看得清楚） 铀盐（铀盐（U,92） 大多数细胞成分均可，特易于核

7、酸复染复染 醋酸铀（黄色有毒晶体，见光分解） 50-70%乙醇饱和溶液，放置过夜，取上清 避光（棕色光口瓶，黑纸罩上） 柠檬酸铅（有毒） 1.33g硝酸铅+1.76柠檬酸钠（2水）in 50ml dd水+浓NaOH数滴 避CO2（水去CO2，口吹， NaOH 颗粒） 醋酸铀30m，漂洗 柠檬酸铅37m（不宜过长），漂洗 0.02N NaOH分色，漂洗 *染液配好后可使用半年左右，放置较久的染液离心一下效果好半薄切片对于不均匀的组织重要 厚度0.5微米（介于光与超薄之间） 载玻片水滴上70-80 C展开，烤干 相差显微镜观察 经甲苯胺兰（1%）染色后观察，可用无水乙醇分色22 溶液成膜溶液成膜对象分散颗粒1000埃： 细胞碎片，病毒，生物大分子适当溶液浓度悬滴法，喷雾法负染负