实验八不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳ppt课件

1、http:/ 认清试剂试剂和吸管对号、量器的运用认清试剂试剂和吸管对号、量器的运用 封管封管 分别胶配制与灌胶浓度为分别胶配制与灌胶浓度为6%6%，化学聚合，化学聚合，A1C2H2G5A1C2H2G5，每组总，每组总体积为体积为10ml10ml，灌胶高度为，灌胶高度为7-8cm7-8cm封正丁醇封正丁醇3mm3mm手法、高度、手法、高度、15min15min左右出现折光线时可进展左右出现折光线时可进展下一步操作下一步操作1.1 分别胶的配制分别胶的配制http:/ 5http:/ 浓缩胶的配制浓缩胶的配制http:/ 安装、加样、电泳安装、加样、电泳http:/ 2.1 电泳的概念电泳的概念h

2、ttp:/ 2.2 电泳的根本原理电泳的根本原理http:/ 2.3 电泳分别蛋白质的原理电泳分别蛋白质的原理http:/ 实验室中常用到的电泳方法实验室中常用到的电泳方法 以介质分类以介质分类http:/ 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称，简称PAGE)是以聚是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。电泳技术。 1、聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和、聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲基双丙烯酰胺聚合而构成的三维网状甲基双丙烯酰胺聚

3、合而构成的三维网状构造，聚合过程由自在基催化完成。构造，聚合过程由自在基催化完成。 2、催化聚合的常用方法有两种：化学、催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。聚合法和光聚合法。 (1)在化学聚合过程中，以过硫酸铵在化学聚合过程中，以过硫酸铵AP为催化剂，以四甲基乙二胺为催化剂，以四甲基乙二胺TEMED为加速剂为加速剂, TEMED催化催化AP产生自在基；产生自在基； (2)在光聚合过程中，以核黄素为催化剂，在光聚合过程中，以核黄素为催化剂，光催化核黄素产生自在基。自在基引发光催化核黄素产生自在基。自在基引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲基双丙烯酰丙烯酰胺单体聚合，同时甲基双丙烯酰胺与丙烯酰

4、胺链间产生甲基键交联，从胺与丙烯酰胺链间产生甲基键交联，从而构成三维网状构造。而构成三维网状构造。http:/ 聚丙烯酰胺凝胶的特性聚丙烯酰胺凝胶的特性(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；性能好；(2)化学性能稳定，与被分别物不起化学反响，化学性能稳定，与被分别物不起化学反响，在很多溶剂中不溶；在很多溶剂中不溶；(3)对对pH和温度变化较稳定；和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只需几乎无吸附和电渗作用，只需Acr纯度高，纯度高，操作条件一致，那么样品分别反复性好；操作条件一致，那么样品分别反复性好；(5)样品不易分散，且用量少，其灵

5、敏度可达样品不易分散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调理，根据被分别物的分子量凝胶孔径可调理，根据被分别物的分子量选择适宜的浓度，经过改动单体及交联剂的选择适宜的浓度，经过改动单体及交联剂的浓度调理凝胶的孔径；浓度调理凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不延续凝胶电泳中，集分辨率高，尤其在不延续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因此较醋浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因此较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。辨率。http:/ 聚丙烯酰胺凝胶电泳的分类聚丙烯酰胺凝胶电泳的分类1. 根据其有无浓缩效应，分为：根据其有无浓缩效

6、应，分为：1延续系统延续系统延续系统电泳体系中缓冲液延续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度一样，带电颗粒在电场作用值及凝胶浓度一样，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应下，主要靠电荷和分子筛效应 2不延续系统不延续系统不延续系统中由于缓冲液不延续系统中由于缓冲液离子成分，离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不延，凝胶浓度及电位梯度的不延续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因此其应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因此其分别条带明晰度及分辨率均较前者佳。分别条带明晰度及分辨率均较前者佳。 2. 根据蛋白质样品变性与否，

7、分为：根据蛋白质样品变性与否，分为：1变性电泳变性电泳也就是也就是SDS-PAGE，蛋白质，蛋白质失去二三级构造；失去二三级构造；2非变性电泳非变性电泳 蛋白质可以坚持完好形状，蛋白质可以坚持完好形状，并根据蛋白质的分子量大小、蛋白质的外形并根据蛋白质的分子量大小、蛋白质的外形及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。3.根据电泳槽体系的类型，分为：根据电泳槽体系的类型，分为： 1圆盘电泳圆盘电泳2板状电泳板状电泳两者电泳原理完全一样。两者电泳原理完全一样。 http:/ SDS-PAGE SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术仅根据

8、蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由最初由shapiroshapiro于于19671967年建立，他们发如今样品介质和丙烯酰胺凝胶中参年建立，他们发如今样品介质和丙烯酰胺凝胶中参与离子去污剂和强复原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分与离子去污剂和强复原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小可以忽略电荷要素，其原理在于：子量的大小可以忽略电荷要素，其原理在于：1.1.去电荷：由于去电荷：由于SDSSDS十二烷基硫酸钠产生的十二烷基硫酸根带负电，十二烷基硫酸钠产生的十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质使各种蛋白质-SDS-SDS复合物都带上一样密度的负电荷，

9、它的量大大超越了蛋复合物都带上一样密度的负电荷，它的量大大超越了蛋白质分子原的电荷量，白质分子原的电荷量， 因此掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别；因此掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别； 2.2.破坏构造：破坏构造：SDSSDS能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级构造。假设蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中白分子的二、三级构造。假设蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中能够会构成分别对应于各个亚基的几条带；能够会构成分别对应于各个亚基的几条带； 3.3.一致构象：一致构象：SDSSDS与蛋白质结合后，还可引起构象

10、改动，蛋白质与蛋白质结合后，还可引起构象改动，蛋白质-SDS-SDS复合复合物构成近似物构成近似“雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDSSDS复合物的短轴长复合物的短轴长度都一样，约为度都一样，约为18A18A； 这样的蛋白质这样的蛋白质-SDS-SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原来的复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原来的电荷和外形的影响，而取决于分子量的大小。电荷和外形的影响，而取决于分子量的大小。SDS-PAGESDS-PAGE的原理的原理http:/ 4.1 不延续不延续PAGEPAGE的原理的原理http:/ 不延续体系的组份不延续体系

11、的组份 不延续体系由浓缩胶、分别胶及电极缓冲液所不延续体系由浓缩胶、分别胶及电极缓冲液所组成。组成。1. 浓缩胶是由核黄素催化聚合而成的大孔胶，浓缩胶是由核黄素催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为凝胶缓冲液为pH6.7的的Tris-HC1。2. 分别胶是由分别胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。3. 电极缓冲液是电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。甘氨酸缓冲液。 2种孔径的凝胶、种孔径的凝胶、2种缓冲体系、种缓冲体系、3种种pH值使不值使不延续体系构成了凝胶孔径、延续体系构成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子值、缓冲

12、液离子成分的不延续性，这是样品浓缩的主要要素。成分的不延续性，这是样品浓缩的主要要素。http:/ 样品浓缩效应样品浓缩效应1.凝胶孔径不延续性；凝胶孔径不延续性；2.缓冲体系离子成分及缓冲体系离子成分及pH值的不延续性；值的不延续性；在在pH6.7的凝胶缓冲体系中的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：前导离子或快离子：HC1解离出的氯根解离出的氯根(C1-) 尾随离子尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根或慢离子：甘氨酸根 mclclmppmGG(Cl代表氯根，代表氯根，P代代表蛋白质，表蛋白质，G代表甘氨酸根代表甘氨酸根)有效迁移率有效迁移率=m，m为迁移率，为迁移率，为解离度为解离度)当进入当进入pH8.9的分别胶时，甘氨酸解离度