细胞凋亡实验步骤及注意事项_第1页
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文档简介

1、细胞凋亡实验步骤及注意事项一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死 细胞的方法、实验原理 细胞死亡根据其性质、 起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。 凋亡 普遍存在于生命界, 在生物个体和生存中起着非常重要的作用。 它是细胞在一定 生理条件下一系列顺序发生事件的组合, 是细胞遵循一定规律自己结束生命的自 主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触, 细胞变园,细胞膜向内皱缩、 胞浆 浓缩、内质网扩张、 细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、 内质网和细胞膜进 一步融合将细胞

2、分成多个完整包裹的凋亡小体, 凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消 化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外, 不会影响其它细胞, 因而不引 起炎症反应。在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核 DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断, 降解为 180-200bp 或它的整倍数的各 种片断。如果对核 DNA进行琼脂糖电泳,可显示以 180-200bp 为基数的 DNAl adder (梯状带纹)的特征。相比之下, 坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。 细胞在坏死早期即 丧失质膜完整性, 各种细胞器膨胀, 进而质膜崩解释放出其中的内容物, 引起炎 症反应,坏死过程

3、中细胞核 DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的 DNA片断, 不能形成梯状带纹,而呈弥散状。一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡, 通常这些因素在诱导凋 亡的同时, 也可产生细胞坏死, 这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏 感程度。三尖杉酯碱 (HT)是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病, 急性单核白血病 等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明 HT在 0.025 g/ml 范围内作用 2 小时, 即可诱导 HL-60 细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用 1g/ml HT 在 体外诱导培养的 HL-60 细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33

4、342 和碘化丙啶( propidium iodide ,PI )对细胞进行双重染色,可 以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜,一般的生物染料如 PI 等不能穿过质膜。当细胞坏 死时,质膜不完整, PI 就进入细胞内部,它可嵌入到 DNA或 RNA中,使坏死细 胞着色, 凋亡细胞和活细胞不着色。 而一些活细胞染料由于为亲脂性物质, 可跨 膜进入活细胞,因而可进行活细胞染色。 Hoechst33342 是一种活性荧光染料且 毒性较弱,它是双苯并咪唑的一种衍生物。与 DNA特异结合(主要结合于 A-T) 碱基区),显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。、实验用

5、品1、试剂:三尖杉酯碱(HT),300g/ml ,100mmol/L Tris-HCl (pH7.5),5mol/L EDTA缓冲液、碱性裂解液: 0.2mol/L NaOH,1 %SD、S醋酸钠:3mol/L KA(c pH4.8); 异丙醇; 70%乙醇;溴酚蓝,蔗糖指示剂。 TBE电泳缓冲液, 1%琼脂糖,溴乙锭。 PI 母液: 500g/ml ; Ho33342母液: 2mmol/L。2、仪器设备:荧光显微镜,电泳仪,电泳槽,微量加样器(1ml,100l )0.5 、1.5ml 离心管,载玻片,盖玻片。四、实验材料 人早幼粒白血病 HL-60 细胞,用含 10%小牛血清的 RPMI16

6、40培养基在 37,5%CO2 条件下培养。五、方法步骤1、三尖杉酯碱诱发 HL-60 细胞凋亡(1)实验前约 24 小时,接种两瓶 HL-60细胞,标记、,每瓶含约 6ml 培养液,置 37, 5%CO2培养箱培养。(2)实验前约 2.5 小时,当细胞密度达到 70%,号瓶加入三尖杉酯碱 200l , 使终浓度为 1g/ml ,号瓶中加入同等量 PBS(pH7.4)作对照。共同放入培养 箱中继续培养 2.5 小时。2、Ho33342和 PI 双重染色鉴别三种细胞(1)染色:将瓶中的细胞摇匀取 200l于 1.5ml 的离心管中, 加入 Ho33342 母液 2l ,PI 20 l ,染色 1

7、5 分钟。(2)滴片:取一载玻片用双面胶围成一小室,从离心管中各取以上染色后 的细胞悬液 10l ,加入小室内盖上盖玻片,荧光镜下用紫外激发光,高倍镜下 观察,区别三种细胞,并注意三者比例。注意 1. 诱导培养 HL-60 细胞时间要准确;事 2. 荧光显微镜下观察细胞时,由于荧光易碎灭,观察时要尽量快。项细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。其 凋亡普遍存在于生命界,在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细 他 胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,是细胞遵循一定规律自己 结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡

8、细胞与周围细胞脱离接触, 细胞变园, 细胞膜向内皱缩、 胞浆 浓缩、内质网扩张、 细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、 内质网和细胞膜进 一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体, 凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消 化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外, 不会影响其它细胞, 因而不引 起炎症反应。在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核 DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断, 降解为 180-200bp 或它的整倍数的各 种片断。如果对核 DNA进行琼脂糖电泳,可显示以 180-200bp 为基数的 DNAl adder (梯状带纹)的特征。相比之下, 坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。 细胞在坏死早期即 丧失质膜完整性, 各种细胞器膨胀, 进而质膜崩解释放出其中的内容物, 引起炎 症反应,坏死过程中细胞核 DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的 DNA片断, 不能形成梯状带纹,而呈弥散状。一些温和的损

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