细胞凋亡实验步骤及注意事项

1、细胞凋亡实验步骤及注意事项一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死 细胞的方法、实验原理 细胞死亡根据其性质、 起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。 凋亡 普遍存在于生命界， 在生物个体和生存中起着非常重要的作用。 它是细胞在一定 生理条件下一系列顺序发生事件的组合， 是细胞遵循一定规律自己结束生命的自 主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触， 细胞变园，细胞膜向内皱缩、 胞浆 浓缩、内质网扩张、 细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、 内质网和细胞膜进 一步融合将细胞

2、分成多个完整包裹的凋亡小体， 凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消 化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外， 不会影响其它细胞， 因而不引 起炎症反应。在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核 DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断， 降解为 180-200bp 或它的整倍数的各 种片断。如果对核 DNA进行琼脂糖电泳，可显示以 180-200bp 为基数的 DNAl adder （梯状带纹）的特征。相比之下， 坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。 细胞在坏死早期即 丧失质膜完整性， 各种细胞器膨胀， 进而质膜崩解释放出其中的内容物， 引起炎 症反应，坏死过程

3、中细胞核 DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的 DNA片断， 不能形成梯状带纹，而呈弥散状。一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡， 通常这些因素在诱导凋 亡的同时， 也可产生细胞坏死， 这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏 感程度。三尖杉酯碱 （HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病， 急性单核白血病 等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明 HT在 0.025 g/ml 范围内作用 2 小时， 即可诱导 HL-60 细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用 1g/ml HT 在 体外诱导培养的 HL-60 细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33

4、342 和碘化丙啶（ propidium iodide ，PI ）对细胞进行双重染色，可 以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如 PI 等不能穿过质膜。当细胞坏 死时，质膜不完整， PI 就进入细胞内部，它可嵌入到 DNA或 RNA中，使坏死细 胞着色， 凋亡细胞和活细胞不着色。 而一些活细胞染料由于为亲脂性物质， 可跨 膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。 Hoechst33342 是一种活性荧光染料且 毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与 DNA特异结合（主要结合于 A-T） 碱基区），显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。、实验用

5、品1、试剂：三尖杉酯碱（HT），300g/ml ，100mmol/L Tris-HCl （pH7.5），5mol/L EDTA缓冲液、碱性裂解液： 0.2mol/L NaOH,1 %SD、S醋酸钠：3mol/L KA（c pH4.8）； 异丙醇； 70%乙醇；溴酚蓝，蔗糖指示剂。 TBE电泳缓冲液， 1%琼脂糖，溴乙锭。 PI 母液： 500g/ml ； Ho33342母液： 2mmol/L。2、仪器设备：荧光显微镜，电泳仪，电泳槽，微量加样器（1ml，100l ）0.5 、1.5ml 离心管，载玻片，盖玻片。四、实验材料 人早幼粒白血病 HL-60 细胞，用含 10%小牛血清的 RPMI16

6、40培养基在 37，5%CO2 条件下培养。五、方法步骤1、三尖杉酯碱诱发 HL-60 细胞凋亡（1）实验前约 24 小时，接种两瓶 HL-60细胞，标记、，每瓶含约 6ml 培养液，置 37， 5%CO2培养箱培养。（2）实验前约 2.5 小时，当细胞密度达到 70%，号瓶加入三尖杉酯碱 200l ， 使终浓度为 1g/ml ，号瓶中加入同等量 PBS（pH7.4）作对照。共同放入培养 箱中继续培养 2.5 小时。2、Ho33342和 PI 双重染色鉴别三种细胞（1）染色：将瓶中的细胞摇匀取 200l于 1.5ml 的离心管中， 加入 Ho33342 母液 2l ，PI 20 l ，染色 1

7、5 分钟。（2）滴片：取一载玻片用双面胶围成一小室，从离心管中各取以上染色后 的细胞悬液 10l ，加入小室内盖上盖玻片，荧光镜下用紫外激发光，高倍镜下 观察，区别三种细胞，并注意三者比例。注意 1. 诱导培养 HL-60 细胞时间要准确；事 2. 荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。项细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。其 凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细 他 胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己 结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡

8、细胞与周围细胞脱离接触， 细胞变园， 细胞膜向内皱缩、 胞浆 浓缩、内质网扩张、 细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、 内质网和细胞膜进 一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体， 凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消 化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外， 不会影响其它细胞， 因而不引 起炎症反应。在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核 DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断， 降解为 180-200bp 或它的整倍数的各 种片断。如果对核 DNA进行琼脂糖电泳，可显示以 180-200bp 为基数的 DNAl adder （梯状带纹）的特征。相比之下， 坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。 细胞在坏死早期即 丧失质膜完整性， 各种细胞器膨胀， 进而质膜崩解释放出其中的内容物， 引起炎 症反应，坏死过程中细胞核 DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的 DNA片断， 不能形成梯状带纹，而呈弥散状。一些温和的损