芪龙胶囊的质量标准研究

1、芪龙胶囊的质量标准研究叶素艳1，李振1，周海洋1, 谢敏1,刘瑞琛2,许丽丽3(1.济宁华能制药厂有限公司，山东 济宁 272000；2. 山东大学药学院，山东 济南 2500003.山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101)摘要：目的：修订芪龙胶囊的质量标准。方法：采用薄层色谱法对方中丹参、赤芍进行鉴别，采用高效液相色谱法测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。色谱柱为C18（250 mm×4.6 mm,5 µm）, 以乙腈为流动相A，以0.2%甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为260nm，柱温30，流速1.0ml/min。结果：TLC鉴别专属性强，分离度好；毛

2、蕊异黄酮葡萄糖苷在浓度2575µg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。平均回收率为99.9%。结论：本方法简便，灵敏，准确，快速，专属性强，重现性好等优点，适合于该药的质量分析检验。关键词：芪龙胶囊；质量标准；丹参；赤芍；毛蕊异黄酮葡萄糖苷Quality standard of Qilong CapsuleYE Su-yan1, LI Zhen1, ZHOU Hai-yang1, XIE Ming1，LIU Rui-chen2,XU Li-li3 (1. Jining Huaneng Pharmaceutical Factory, Jining 272000, China; 2.

3、School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University, Jinan 250000, China；3. Shandomg Provincial Institute for Food and Drug Control, Jinan 250101, China)ABSTRACT: OBJECTIVE: To revise the quality standard of Qilong Capsule. METHODS: Using TLC method to identify the Radix Salviae Miltiorrhizae and

4、 Radix Paeoniae Rubra, and the content of Calycosin-7-glucoside was determined by HPLC. The chromatographic column is C18（250 mm×4.6 mm,5 µm）, with acetonitrile as mobile phase A and 0.2% formic acid solution as mobile phase B for gradient elution, the detection wavelength is 260nm, the co

5、lumn temperature is 30 , and the velocity is 1.0ml/min. RESULTS: The specificity of TLC identification is strong, and the separation degree is good. Calycosin-7-glucoside has a good linear relationship in the 2575µg/ml range of concentration, and the average recovery rate is 99.9%. CONCLUSION:

6、The advantages of this method were simple, sensitive, accurate and rapid, with a good specificity and reproducible, so it's suitable for the quality analysis and testing of Qilong Capsule.KEY WORDS: Qilong Capsule; quality standard; Radix Salviae Miltiorrhizae; Radix Paeoniae Rubra; Calycosin-7-

7、glucoside 收稿日期：作者简介：叶素艳（1982），女，执业药师，从事药物检验分析，电话，“芪龙胶囊”以一组溶栓酶（蚓激酶）为基础，加之特殊工艺提取的黄芪、丹参、当归等中药的有效成分，具有活血化瘀、溶栓通络的功效。为了提高标准对产品质量的可控性，在原有已修订质量标准1和局颁标准2的基础上，对标准进行了完善与提高。其中黄芪为君药，根据2015年版中国药典规定，黄芪含量指标新增毛蕊异黄酮葡萄糖苷，为了制剂的质量得到更大的提高，新增毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定项。中药成份复杂，且在不同中药中可能含同一个成份，如芍药苷在白芍3等中药中也可检测到。因此，单一用标准品去对复方中药进行定性鉴别存在一

8、定的缺陷。本文修订了赤芍和丹参的TLC鉴别，在以标准品为对照的基础上，加以标准药材对芪龙胶囊中赤芍和丹参进行定性鉴别。1 仪器与试药1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪，ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm×5 µm），分析天平（Sartorius,BS210S,Max 210g,d=0.1 mg）。1.2 试药 丹参，批号120923-201414；丹酚酸B，批号111562-201009；芍药苷，批号110736-200934；赤芍，批号121093-200402；毛蕊异黄酮葡萄糖苷（供含量测定用，批号111920-2015

9、05，含量以97.1%计），以上对照品和对照药材均由中国食品药品检定研究院提供。芪龙胶囊(济宁华能制药厂有限公司生产，规格：0.2 mg/粒；批号160613，160614，161122,161223,170101），乙腈为色谱纯，其余为分析纯。2 试验方法和结果2.1 丹参的鉴别参考中国药典2015年版白蚀丸品种项下的薄层色谱条件4，具体试验如下：供试品溶液的制备：取本品内容物8 g，加甲醇50 ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水40 ml使溶解，用石油醚（6090）40 ml振摇提取，分取水层，加稀盐酸调pH值至23，再用乙醚振摇提取2次，每次30 ml，合并乙醚提取液，挥干

10、，残渣加甲醇l ml使溶解，作为供试品溶液。点样量5 µl。对照药材溶液的制备：取丹参对照药材0.5 g，加甲醇20 ml，超声处理20 min，滤过，滤液浓缩至l ml，作为对照药材溶液。点样量5µl。对照品溶液制备：取丹酚酸B对照品，加甲醇制成每l ml含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。点样量5 µl。阴性对照药材溶液的制备：取处方中除去丹参的其他药味，按处方比例制成缺丹参的阴性对照样品。取阴性对照样品8 g，同供试品溶液的制法，制成阴性对照溶液。点样量5 µl。薄层板：青岛海洋化工厂分厂生产的硅胶G薄层板，批号：20150912 Merck公司

11、G板，批号：HC30863956展开剂：甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（4:6:8:1:4） 显色：5%三氯化铁乙醇溶液结果：优化后的谱图中，日光下，供试品色谱中，在与丹参对照药材和丹酚酸B对照品相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。比较不同的薄层板及不同温湿度条件，结果色谱图中均斑点清晰、分离效果较好。如图1所示，样品分别为1. 阴性对照2. 样品（批号：161122）3. 样品（批号：161223）4. 样品（批号：170101）5. 丹参对照药材。 图1 丹参的TLC鉴别图谱（A：Merck硅胶G板，温度20，湿度50%；B：青岛海洋化工厂硅胶G板，温度4，湿度30%)Fig

12、.1. TLC identification of Salvia (A: Merck silica gel G plate, temperature 20 , humidity 50%; B: Qingdao Ocean Chemical Plant silica gel G plate, temperature 4 , humidity 30%)2.2 赤芍的鉴别原标准方法中2，供试品色谱中在与对照品芍药苷相应的位置上有其他斑点干扰，分离效果不是很好，如图2（A)所示。增加柱分离纯化，同时增加赤芍对照药材的鉴别，具体试验如下：供试品溶液的制备：取本品内容物3g，加80%乙醇50ml，超声处理

13、10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次15ml，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，加在中性氧化铝柱（100200目，2g，内径1cm）上，用甲醇-乙酸乙酯（1:1）50ml洗脱，收集洗脱液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。点样量5µl。对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。点样量5µl。对照药材溶液的制备：取赤芍对照药材1g，同法制成对照药材溶液。点样量5µl。阴性对照药材溶液的制备：取处方中除去赤芍的其他药味，按处方比例制成缺赤芍的阴性对照样品。取阴性对照样

14、品3g，同供试品溶液的制法，制成阴性对照溶液。点样量5µl。薄层板：青岛海洋化工厂分厂生产的硅胶G薄层板，批号：20150912 Merck公司G板，批号：HC30863956展开剂：三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40:5:10:0.2）显色：喷以5%香草醛硫酸溶液，在105加热至斑点显色清晰结果：优化后的谱图中，日光下，供试品色谱中，在与赤芍对照药材和芍药苷对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。比较不同的薄层板及不同温湿度条件，结果色谱图中均斑点清晰、分离效果较好，如图2所示，图A为赤芍药材原标准方法（Merck硅胶G板），图B、图C为优化后薄层鉴别结果，其中1.

15、阴性对照2.样品（批号：161122）3.样品（批号：161223）4.样品（批号：170101）5.芍药苷对照品6. 赤芍对照药材 图2 赤芍药材的TLC鉴别图谱（A：Merck硅胶G板原标准图谱，温度 20；湿度 45%；B 优化后Merck硅胶G板谱图，温度 20，湿度45%；C优化后青岛海洋化工厂硅胶G板谱图，温度4，湿度25%）Fig.2. TLC identification results of Radix Paeoniae Rubra (A:standard chromatogram of Merck silica gel G plate,temperature 20 ; hu

16、midity 45%; B optimized result of Merck silica gel G plate , temperature 20 , humidity 45%; C optimized result of Qingdao Ocean Chemical Factory silica gel G plate, temperature 4 , humidity 25%)2.3 毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定 参考中国药典2015年版黄芪项下的含量测定条件5，具体试验如下。2.3.1 色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.2%甲酸溶液为流动

17、相B，按表8中的规定进行梯度洗脱；检测波长为260nm，柱温30，流速1.0ml/min。理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于3000。表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution table时间（分钟）流动相A（%）流动相B（%）02020408060203040602.3.2 对照品溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50µg的溶液，摇匀，即得。2.3.3 供试品溶液的制备 取本品内容物2g，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续

18、滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。2.3.4 阴性对照溶液的制备 取处方中除去黄芪的其他药味，按处方比例制成缺黄芪的阴性对照样品。取阴性对照样品2g，同供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。2.3.5 稳定性考察 称取160614批芪龙胶囊2.0574g，制备成供试品溶液，进样10µl测定，分别于0、2、4、6、8小时进样，测得峰面积，结果见表2。表2 稳定性试验测定结果Table 2 Result of stability test时间（h）02468峰面积1680.554811713.630371681.334961658

19、.537721664.31165RSD(%)1.28 测定结果表明供试品溶液在8小时内稳定，能满足测定要求。2.3.6 线性关系的考察 精密称取对照品12.60mg，加甲醇溶解并稀释至25ml量瓶中，分别精密量取0.5，0.75，1.0，1.25，1.5ml对照品溶液置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样10µl，测得峰面积，结果见表3。以浓度C（µg/ml）为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，见图3，得回归方程y=30.4575x+37.0256,r=0.9997。表3 线性关系考察结果Table 3 Results of linear relationsh

20、ip量取体积（ml）浓度(µg/ml)峰面积1峰面积2峰面积平均值0.525795.68231772.35199784.017150.7537.51198.222661199.827761199.025211.0501553.383671557.818481555.6010751.2562.51950.500241944.471071947.4856551.5752337.353032289.412842313.382935图3线性关系考察图Fig. 3. Linear relationship result 结果表明,毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品在浓度2575µg/ml范围内

21、与峰面积呈良好的线性关系。2.3.7 重复性试验 取芪龙胶囊（批号为160613），按正文所述供试品溶液制备方法，平行制备6份供试品溶液，并测定含量，结果见表4。结果表明，本方法的重复性良好。表4 重复性试验结果Table 4 Repeatability test results面积平均值取样量/g含量/mg/粒RSD/%芪龙160613A1677.364082.00580.1051.51芪龙160613B1750.497622.00150.110芪龙160613C1717.259952.00480.107芪龙160613D1709.589852.00030.107芪龙160613E1691.

22、231142.00110.106芪龙160613F1716.288582.00540.1072.3.8 专属性试验 分别精密吸取重复性试验中的对照品溶液，供试品溶液及阴性对照溶液各10µl，注入液相色谱仪，进行测定，结果供试品色谱中，在与对照品色谱保留时间相同的位置上，有相应的色谱峰，而阴性对照色谱中无相应色谱峰。说明处方中其他药味对测定结果无干扰。见图4。从上到下分别是阴性对照，毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，芪龙胶囊样品。图4 专属性试验HPLC色谱图Fig.4. HPLC chromatogram of specificity test2.3.9 准确度考察精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品约13mg，加甲醇溶解并定容至25ml量瓶中，摇匀。精密吸取10ml，用甲醇定容至200ml量瓶中，摇匀，即得对照品稀释溶液。精密称取已知含量为0.11mg/粒的160613批芪龙胶囊约1g，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇25ml，再加入对照品稀释溶液25ml，按正文含量测定方法依法测定。平行制备同批供试品6份，分别计算回收率，结果见表5，结果表明方法的回收