实验二、植物叶绿素含量测定----丙酮提取法(精)

1、二、植物叶绿素含量测定-丙酮提取法高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素（光合色素）吸收的。叶绿体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。叶绿体色素的提取、分 离和测定是研究它们的特性以及在光合中作用的第一步。叶片叶绿素含量与光合 作用密切相关，是反映叶片生理状态的重要指标。在植物光合生理、发育生理和 抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。叶绿素含量也是指导作物栽培生产和 选育作物品种的重要指标。原理叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚 碉等研磨提取或浸泡提取。叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸 收，用分光光度计测定在该波长下叶绿

2、素溶液的吸光度（也称为光密度），再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。利用分光光计测定叶绿素含量的依据是 Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过 溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。其数学表达式 为：A=Kbc式中：A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663、645nm处。叶绿素a和b在663nm处的吸光系数（当溶液厚度为1cm,叶绿素浓度为g L-1 时的吸光度）分别为82.04和9.27;在645nm处的吸光系数分别为16.75和 45.600根据Lambert-Beer

3、定律,叶绿素溶液在 663nm和645nm处的吸光度（A663 和A645）与溶液中叶绿素a、b和总浓度（a+b） （ Ca、Cb、Ca十b,单位为 g L-1）,的关系可分别用下列方程式表示： A663=82.04Ca+9.27Cb （1）A645=16.76Ca+45.60Cb （2）解方程（1）和（2）得：Ca=12.7 A663 2.59 A645 （3）Cb=22.9 A645 4.67 A663 （4）Ca十 b = 20.3 A6458.04 A663 （5）从公式（3）、（4）、（5）可以看出，只要测得叶绿素溶液在 663nm和645nm 处的吸光度，就可计算出提取液中的叶绿素

4、 a、b浓度和叶绿素总浓度（a+b）。在652nm处，叶绿素a和b的吸光系数相同，因此提取液中叶绿素的总浓度（a+b）也可通过测定溶液在波长 652nm处的吸光度（A652）求得，其计算公式 为：A652 X100034.5Ca+b= （6）式中：34.5为叶绿素a和b在波长652nm处的吸光系数。但Inskeep等（1985）认为叶绿素a和b吸光系数相等时的波长位于吸收光谱斜 率很陡的位置上，因此仪器波长很小的偏差都可能导致很大的测定误差。所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算：C WAX1000叶绿素含量（mgg-1或mg dm-2） = （7）式中：C为叶绿素浓度（m

5、gL-1）或mg dm-2） ； V为提取液总体积（ml） ； A 为取样鲜重（g）或取样面积（dm-2） o材料、仪器、药品1 .材料：植物绿色叶片。在本实验中利用光合速率测定实验中取回室内的绿色 半叶和黄色半叶为试材。2 .仪器：（1）分光光度计；（2）天平；（3）研钵；（4）滤纸；（5）漏斗；（6） 5ml移 液管；打孔器；（8）滴管；（9）剪刀；（10） 25ml容量瓶；（11）毛刷；（12）擦镜纸。方法1 .取样：用毛笔或毛刷清除叶片表面的灰尘，用打孔器从绿叶和黄叶上各打取 0.25dm-2的叶圆片，立即称重，剪碎后放入研钵中。（在正规实验中应各重复3次，本实验为减少丙酮向环境中的排

6、放，故不设重复）。注意取样时要避开大的 叶脉。如果需要计算叶片干样叶绿素含量，另取一份相同样品置于烘箱中烘干， 用于测定干重。2 .研磨提取：向研钵中加入 80%丙酮2.5ml,以及少许CaCO3 （中和酸性，防止 叶绿素酯酶分解叶绿素）和石英砂，研磨成匀浆，再加入 3ml 80%丙酮，继续研 磨至组织变白，在暗处静止35min后，用一层干滤纸过滤到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%丙酮将研钵洗 净，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用 80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸 和残渣全部变白后，用80%丙酮定容至刻度。3 .读取吸光度：取厚度为lcm的洁净比色皿，注意不要用手接触比色皿的光 面，先用

7、少量色素提取液清洗 23次，注意清洗时要使清洗液接触比色皿内壁的 所有部分，然后将色素提取液倒入比色皿中，液面高度约为比色皿高度的4/5,将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸掉（注意不能擦），再用擦镜纸擦干擦净。将 比色皿放入仪器的比色皿架上，注意不要将溶液撒入仪器内。第一个位置放盛有 80%丙酮的比色皿，做为空白对照。将仪器波长分别调至663、645、652nm处， 以80%丙酮做为空白对照调透光率100%,分别测定溶液在上述三个波长下的吸 光度。每个样品重复测定3次。注意，每次在转换波长时，都要用 80%丙酮调透 光率100%。4 .结果计算：将645、663、652nm处测得的吸光度代入公式（3）、（ 4）、 （5）、（6）中计算叶绿素a、b浓度和总浓度。再将叶绿素a、b浓度和总浓度代入公式（7）中求出所测材料单位重量或单位面积的叶绿素a、b含量和总含量。实验结果记录1 .实验材料：植物名称：种植地点：发育时期：试验处理：植物的生长状况：取样时间：取样部位及数量：2 .测定地点：3 .测定时间：年月 日时分至时分4 .测定条件记录：5 .数据记录及结果记载：表1测定数据记录及计算结