整胚原位杂交

1、组织学与病理学技术实验报告 实验名称：使用整胚原位杂交方法定位观察斑马鱼胚her4 基因的表达使用整胚原位杂交方法定位观察斑马鱼胚胎her4 基因的表达一、实验目的： 1）通过本实验掌握原位杂交的基本原理及方法。 2）观察her4基因在斑马鱼胚胎的表达位置。二、实验原理：原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-

2、RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。我们这儿所介绍的一种原位杂交的方法是通过后者，以地高辛标记探针，然后用酶联抗体的方法

3、进行检测。三、实验试剂及仪器 1、实验试剂：系统水、4%聚甲醛、PBS溶液、甲醇（70%、50、30）、蛋白酶K的PBST溶液（在管中原有的约1mlPBST中加入1 l 10mg|ml的蛋白酶K，终浓度10 g|ml）、H2O2（3%H2O2；0.5M NaOH）、PBST溶液、HYB溶液、RNA探针、50%甲酰胺、2×SSCT溶液、0.2×SSCT溶液、MABT、阻断溶液、羔羊清:MABT=1:9的溶液、AP底物染色缓冲液。所用试剂的配制：原位杂交中溶液的配制：保存溶液配制1）10*PBS:每1L溶液：1.37M(mol/L的简写) NaCl 80g27mM KCl 2g

4、43mMNa2HPO4·12HO(14.7g)或无水Na2HPO4（6.1g）14mM KH2PO4 1.9gDEPC水（购买） 1LHCl调PH值至7.3灭菌2）PBST：PBS溶液加上Tween-20使其终浓度为0.1%。20*SSC:每1L溶液：0.3m 柠檬酸钠88g3M NaCl175.3gDEPC水至1L灭菌3）SSCT：SSC加上Tween-20使其终浓度为0.1%。4）HYB：每100ml溶液：50%甲酰胺5*SSC50 g/ml 肝素0.5 mg/ml核糖体RNA加入Tween-20使其终浓度为0.1%-20保存5）MAB：1000 ml100 mM 马来酸（顺丁烯

5、二酸）11.69g150 mM NaCl8.89g用固体NaOH（约7g）调至Ph=7.54保存6）MABT：MAB加上Tween-20使其终浓度为0.1%.7）10% 阻断试剂阻断试剂粉末溶于MAB溶液中，质量体积比为1：10。高温高压灭菌，-20 保存。8）热处理羔羊血清将羔羊血清56 ，30 min热处理获得。分装，-20保存。现配溶液1）阻断溶液：2500ul热处理羔羊血清:10%BM阻断试剂:MABT=1:2:7。用后剩余溶液丢弃，防止血清变质。2）检测缓冲液又称AP缓冲液 每20ml溶液 H2O 16600 l100mM NaCl 400 l 50mM Mgcl2 1000l 10

6、0mM 三羟甲基氨基甲烷（Tris）HCl 2000 l 10% Tween20; 200ul3）碱性磷酸酶底物染色缓冲液检测缓冲液 1ml NBT/BCIP 20 l2、实验器材及仪器：4冰箱、光学显微镜、正置相差 荧光显微镜、恒温水浴锅、24孔板、EP管、移液枪四、实验步骤:本实验开始前已将胚胎固定好。固定方法如下：收集斑马鱼的胚胎，在Holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用4%多聚甲醛固定，在4保存，二十四小时后用PBS溶液洗入水相，显微镜下剥去卵膜，然后换成甲醇，在-20C 保存，待用。原位杂交第一天：1、 重新水化和固定 1） 吸取固定好的胚胎，加入70%甲醇（MeOH

7、）的PBST溶液，放置5分钟。2） 置换成50甲醇的PBST溶液，放置5分钟3） 置换成30甲醇的PBST溶液，放置5分钟4） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。5）用蛋白酶K的PBST溶液（在管中原有的约1mlPBST中加入1 l 10mg|ml的蛋白酶K，终浓度10 g|ml）在室温下处理胚胎，时间可参考下表：胚胎时期处理时间5S酌情处理6S30秒16S1分钟18S，24S2分钟48h(H2O2脱色)4分钟3d(H2O2脱色)10分钟6）消化时间到后，先尽快用PBST暂时漂洗。7） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。2、预杂交1）每个管中置换成大约300lHYB溶液.(溶液覆盖

8、胚胎）2）65水浴，预杂交4小时以上。3、杂交1）用HYB将RNA探针稀释至浓度为0.15-0.25 ng/l(200ulHYB+6ul探针)，72温育5分钟，再冰上放置以破坏形成的可能防碍杂交的二级结构。2）吸去预杂交的HYB，置换为适量体积的含有探针的HYB溶液，65 温浴过夜或12小时左右。原位杂交第二天：1、去除非特异结合的探针1）将探针回收，放于20保存。2）每管加300ulHYB洗一次，20min。3）置换为混有50%甲酰胺的2×SSCT溶液700ul，65放置20分钟，重复一次。4）置换为混有25%甲酰胺的2×SSCT溶液700ul, 65放置20分钟，重复一

9、次。5）置换为2×SSCT，65，放置20分钟, 重复一次。6）置换为0.2×SSCT溶液700ul，65，放置30分钟，重复一次。2、抗体检测1）用MABT洗三次，每次五分钟，室温。2）室温下置换为加阻断溶液，阻断两小时。（200 l覆盖胚胎即可）3）用MABT洗两次，每次五分钟。4）置换为适量被阻断溶液5000倍稀释的地高辛抗体溶液，4 过夜。原位杂交第三天：碱性磷酸酶底物染色1）置换为热处理羔羊血清:MABT=1:9的溶液中，每管700ul室温震摇25分钟。2）MABT洗三次，每次25分钟。3）检测缓冲液洗三次，每次5分钟，每管1ml。其间转移到24孔板。4）加入碱性

10、磷酸酶底物染色缓冲液400ul，避光温育45分钟，37。5）当目标着色出现后，用PBST洗三次，每次5分钟，停止反应。6）观察拍照。五、实验结果分析：从以往的文献中可知，Her4 基因是HES家族成员之一，参与中枢神经系统的发育以及体节边缘的形成。Her4编码一个斑马鱼hairy-E家族的bHLH蛋白。1、从实验结果的图片中可以看出体节区域有该基因的明显表达。从该原位杂交的结果中可以得出her4基因参与了体节的发生。2、但从图片中可以看出her4基因在斑马鱼头部的表达较深，可以推测该基因参与了中枢神经系统的发育3、该实验背景染色过深。六、 讨论：1、该实验背景染色过深，可能与漂洗与染色时间过长

11、有关。2、温度越低，杂交程度越好，但背景可能越深。这是影响最终结果最重要的决定因素之一。her4基因是一个复杂的基因，不仅参与了中枢神经系统的表达也参与体节的形成。但是其具体的分子机制还有待深入研究。通过查阅文献可知notch信号通路参与该基因的表达，并且该基因参与了胚胎的早期发育。七、注意事项：1、溶液的配制极为重要过程中一定要算对浓度和所加体积。2、固定液要选取正确，因为甲醛固定后的组织比较硬，若是做原位杂交，探针不易进入细胞进行结合。3、在实验过程中应特别注意保护标签，MeOH为有机溶剂，易腐蚀油性笔书写的标签。4、蛋白酶K的消化时间应严格控制否则胚胎在后面的实验过程中容易破碎。5、所有的漂洗次数宜多不宜少，漂洗时间也不应太短，染色时间也不应太长，以免背景染色过深。6、实际探针浓度应反复调