HBV全基因组克隆转染细胞系的建立

1、HBa基因组克隆转染细胞系的建立作者：赵艳芳，闫永平，苏海霞，王安辉，张磊，张景霞，门可，徐德忠【关键词】肝炎病毒 , 乙型；基因组, 病毒；克隆, 分子；转染；细胞培养；基因表达【 Abstract 】 AIM: To construct a new cell culture system for producing HBVin : Fulllength HBVDNAwas cloned into pcDNA3vector (named pcDNA33HBV). HepG2 cells were transfected with pcDNA33HBV and screened with an

2、tibiotic G418. HBsAgand HBeAgwere identified by ELISA and HBcAg was identified by immunocytochemical staining. S gene mRNAexpression was tested by RTPCR and HBV DNA in the supernatant of transfected cells was tested by PCR. RESULTS: The plasmid pcDNA33HBV was constructed successfully. After stable t

3、ransfection, HBsAg and HBeAg could be detected in the supernatant of transfected cells. HBcAgpositive staining was located mainly in the cytoplasm. S gene mRNAexpression was verified. S gene and preS gene could be detected in the supernatant by RTPCR. The copies of HBV genome can reach 1 x 108 copie

4、s/L detected by realtime quantitative PCR. CONCLUSION: Rebinant plasmid pcDNA33HBV could be expressed, transcribed and replicated in HepG2 cells. Thistransfectionbased cell culture system could produce high copies of HBV genome.【 Keywords】 hepatitis B virus; genome, viral; cloning, moleculor; transf

5、ection; cell culture;gene expression【摘要】 目的：建立HBVfr外细胞培养体系.方法：构建HBVir基 因克隆质粒pcDNA33HBV稳定转染HepG却月fi, G418筛选.ELISA检测细胞上 消液HBsAg HBeAg勺表达，免疫组化检测细胞内HBcAg的表达，RTPC检测细胞S基因mRNA勺表达，PCR佥测细胞上清液DNA.结果：成功构建了 HBVir基 因克隆质粒pcDNA33HBV稳定转染HepG2t,培养上清HBsAg HBeAgW生，细 胞内HBcA#核浆型分布，且以浆型分布为主.RTPC耻实有HBVS基因mRNA的 表达，上清中HBVS及

6、前S基因阳性，荧光定量PCR佥测显示培养上清中HBV滴 度达1乂108拷贝/匚 结论：重组质粒pcDNA33HBV在HepG农田胞中表达、转 录、复制，该细胞培养体系能产生较高水平的HBV.【关键词】肝炎病毒，乙型；基因组，病毒；克隆，分子；转染；细胞培养；基因表达0 引言由于HBVt主范围窄、动物模型缺乏，体外组织培养也一直没有太大进 展，且不能在体外人工培养，制约了对 HBV勺研究1 1.将HBV DNA专移至靶 细胞，建立表达HBV的体外培养细月fi模型对研究HBVft物学特性和肝炎发病机制 有重要意义2-4 . HBV基因组呈双链闭合环状，基因结构紧凑，具开放读框 分布于全长DNA为使

7、完整的转染基因能在细胞内复制，目的基因的长度要大于 一个HBV DNAI元5-6.我们构建3倍HBV®因的重组真核表达质粒，转染 细胞，以筛选获得稳定表达病毒蛋白的细胞模型，并研究其产生HBV的水平.1 材料和方法材料HBVr基因亚克隆载体 pUC193HBVJ pUC19ft EcoRI及Hind出位点中插入头尾相连的HBV（ adr 亚型）三连体，由山东大学医学院免疫学研究所张秋博士惠赠，保存在大肠杆菌 DH5x中.真核细胞表达载体pcDNA3*第四军医大学生物化学与分子生物学教研室赵晶博士惠赠；人肝母细胞瘤细胞系（HepG2由第四军医大学微生物学教研室惠赠， 本室传代培养；内切

8、酶EcoRI , Hindm, T4 DNA1接酶,Taq DNAi5合酶，反转录酶及 DNAmarker （TakaRa公司）； 质粒提取试剂盒（西安市莱博科技发展有限公司）； LipofectamineTM 20XX（Invitrogen 公司）；DMEM?养基，G418 （Gibco公司）；新生小牛血泊（杭州 四季青生物制品有限公司）；ELISA检测试齐I盒（上海科华生物工程股份有限公司）；SABCfe疫组化11m盒，DA琛色剂（武汉博士德生物 工程有限公司）；S基因，B actin及HBV前S/S基因引物均由北京赛百胜公司 合成 .方法和pcDNA3勺酶切鉴定及目的基因片段的获得过夜培

9、养pUC193HB讨口pcDNA3以质粒提取试剂盒抽提制备 pUC193HBW pcDNA3分另以EcoRI , Hindm单酶切 pUC193HBV以 EcoRI , Hind m双酶切 pUC193HBW pcDNA3 琼 脂糖凝胶电泳分离目的基因，利用胶回收试剂盒回收9600 bp HBS长基因片段和线性 pcDNA3.重组质粒的构建及鉴定 HBV DNAf线性pcDNA”浓度比3 ： 1混合， 在T4 DNA连接酶彳用下4c连接16 h.连接产物转化感受态细胞 DH5x .随机 调取抗性菌落，经小量扩增，提取质粒，分别以 EcoRI , Hind田单酶切并以二 者双酶切，琼脂糖凝胶电泳

10、鉴定后送北京三博远志生物技术有限公司进行序列测定.脂质体介导下pcDNA33HBV因转染转染前一日将处于对数生长期的HepG卸胞用胰酶消化并换无抗生素的 DMEM&养基，将细胞接种于24孔板，密度达90%时进行转染. 转染方法按说明书进行. 24 h 后传代， 48 h 换含600 mg/L G418培养基进行筛选.设未转染的HepG农田胞为对照.待对照组细胞全部死亡后，用含300 mg/L G418 的培养基维持. 筛选过程不含其他抗生素.测抗原表达取转染细胞的上清液用 ELISA法测HBsAg HBeAg.操作及 结果判定按ELISA试剂盒说明书进行，终止反应后10 min内用酶标

11、仪检测A450 nm值.染色法检测细胞中HBcAg的表达Triton X100处理，封闭非特异性抗原 反应，依次加入一抗（兔抗人HBcmAb、生物素化的二抗（羊抗兔IgG）和SABC 复合物，DABS色，脱水透明,封片观察.检测细胞中S基因mRNA勺表达提取细胞总RNA反转录为cDNA,以B actin （sense: 5' CCCAGATCATGTTTGAGACQntisense:5' TAGCTCTTCTCCAGGGAGGA3J参照，扩增片段长度为 361 bp. 以S基 因引物（sense: 5 ' CTGCTGGTGGCTCCAGT;Ta3tisense:5&#

12、39; CAATACCACATCATC3CAT做PCFK应，扩增产物为500 bp.反应条件为94c 预变性 5 min 后开始循环,94 50 s, 55 50 s, 72 55 s ，共30个循环,最后 72延伸5 min. 琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物.检测培养上清中DNA攵集转染细胞上清，提取 DNA以车+对HBVni S/S 基因的引物（sense： 5 ' CGGGATCCCATATTCTTGGGAACAAG3 antisense:5' CACTGCAGGGTTTAAATGTATAQCCAR 扩增片段长度为 1200bp， 反应条件为94预变性5 min 后开始循环，

13、94 45 s, 55 1 min, 722min,共35个循环，最后72c延伸5 min.设质粒pUC193HBV;阳性对照.荧光定量PCR佥测上清中DNA商度取车专染后48 h、转染后1 mo及转染 后3 mo的细胞上清液（经PCR佥测DNAW生）送第四军医大学西京医院临床免 疫科，做荧光定量PCR佥测HBVDNA1度.操作步骤按乙型肝炎核酸扩增荧光检 测试剂盒说明书进行.结果判定为HBVDNAW度1X106拷贝/L为阳性，否则为 阴性 .2 结果,pcDNA*口 pcDNA33HBV酶切鉴定pUC193HB双酶切后，电泳出现两 条带，片段大小约 2900 bp （pUC19和9600 b

14、p （3HBV,单酶切条带均在 9416 bp与23130 bp之间，pcDNA妆酶切为5400 bp的片段.连接产物双酶切后，电 泳出现两条带，分别为 5400 bp （pcDNA3和9600 bp （3HBV,单酶切条带均在9416 bp 与 23 130 bp 之间，与预期结果相符（图 1） ，且测序证实连接正确.1,6: pcDNA3 经 EcoRI 和 Hind m双酶切;2: pUC193HBV 经 EcoRI 和 Hind m双酶切；3: pUC193HBV经 EcoRI 酶切；4: pUC193HBV经 Hind m酶切；5, 10: DNA marker 入 Hindm di

15、gest; 7: pcDNA33HBV 经 EcoRI 和 Hind m双酶切； 8: pcDNA33HBVS EcoRI 酶切;9: pcDNA33HBV 经 Hind m酶切.抗G418细胞克隆的形成及筛选转染后 4 wk内对照组HepG农田胞在G418 的作用下全部死亡，同时转染 pcDNA33HBV HepG2ffi胞阳性克隆形成.挑取阳 性克隆继续用G418筛选培养，建立了携带 HB"基因的细胞系.SA 法检测 HBsAgffi HBeAgft达4染 pcDNA33HBV胞组上清中 HBsAg, HBeAgt匀 阳性，而对照组HepG农田胞上消始终为阴性.在HepG卸胞中的

16、表达转染pcDNA33HBV细胞内HBcAgJ核浆型分布， 以浆型分布为主.未转染的HepG2ffi胞未见染色（图2）.S基因mRNA!达的检测以转染细胞 cDNAPCRT增B actin ,在250 bp 与500 bp间可见特异性条带，说明cDNAW量良好，转染pcDNA33HBV细胞S 基因引物扩增产物为500 bp （ 图 3）. 对照组细胞未见扩增条带.培养上消HBV DNA佥测车专染pcDNA33HBV细胞培养上消PCRT增出 1200 bp的阳性条带，为HBV#异Tt前S/S基因，与阳性对照相同.对照组HepG2 细胞未出现阳性条带（ 图 4）.荧光定量PCR佥测上清中DNA商度

17、”专染pcDNA33HBV细胞培养上清中 HBV商度分别为 48 h: 1乂108拷贝儿；1 ma 4X107 拷贝/L; 3 ma 7X 107 拷贝 /L.3 讨论随着分子生物学的发展, 将重组基因转入动物细胞并表达已成为确定和分析功能基因产物的有力手段，大大促进了 HBV勺研究.有研究报道，迄今用于 繁殖HBV的所有组织培养系统，都是用串联的HBVS因组，常在很强的外源性启 动子的控制下，这些系统可用于生成大量病毒1 . 我们构建的pcDNA33HBV，含完整的头尾串联的HBV基因，载体pcDNA那有CM"期启动增强子，转染 细胞后，能有效合成和分泌HBsAg HBeAg. R

18、TPCR®示转染细胞有HBV#异性 S基因mRNA勺表达，证实该转染细胞中存在 HBV专录、复制过程.且转染细胞 上清中扩增出前S/S基因，即整个S区，说明有病毒DNA勺存在.其中前S1蛋 白位于完整的病毒颗粒（Dane颗粒）表面，与病毒的装配和感染密切相关7,具有与肝细胞受体结合的位点1 . 由此说明转染细胞可分泌结构较完整的病毒颗粒.荧光定量PCR!一步证明该细胞系能产生较高滴度的HBV DNA.如同细胞系8,该细胞模型可望作为一种新的 HB#外细胞培养体系, 其将为HBV勺后续研究奠定实验基础.它的优点在于病毒复制可持续很长时间， 且可传代培养. 另外， 转染细胞以固定的拷贝数

19、整合于宿主细胞染色体上，复制方式有别于自然感染，其不能用于病毒吸附、透过及脱衣壳过程的研究. 国外学者利用转染细胞的培养上消感染细胞研究HBV勺感染机制9-10，我们已经利用阳性血清成功感染了 HepG农田胞11和原代培养的滋养层细胞，将浓缩纯化 此细胞分泌的HBV建立接近自然状态的HBV®染模型，进行HBV勺感染机制及 胎盘滋养层细胞上特异性受体的研究.【参考文献】 1 骆抗先 . 乙型肝炎病毒基础和临床M . 北京： 人民卫生出版社， 20XX:41-86. 2 Parekh S, Zoulim F, AhnSH, et al. Genomereplication, virion

20、secretion, and e antigen expression of naturally occurring hepatitis B virus core promoter mutants J . J Virol, 20XX,77(12):6601-6612. 3 唐霓 , 黄爱龙 , 张秉强 , 等 . 倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及在HepG2g胞中的表达J.中华肝脏病杂志，20XX,11(8):464-466. 4 Fellig Y, Almogy G, Galun E, et al. A hepatocellular carcinoma cell line produ

21、cing mature hepatitis B viral particles J . BiochemBiophys Res Commun, 20XX,321(2):269-274. 5 Lu X, Block TM, Gerlich WH.Proteaseinduced infectivity of hepatitis B virus for human hepatoblastoma cell line J . J Virol,1996,70(4):2277-2285. 6 倪宏 , 骆抗先 , 朱幼芙 , 等 . 乙型肝炎病毒全基因在肝癌细胞中的转染与表达J . 第一军医大学学报,20XX,21(7):501-502. 7 Ryu CJ, Gripon P, Park HR, et al. In vitro ne