大蒜SOD的提取与分离

1、大蒜SOD的提取与分离1、 实验目的： 1、熟悉大蒜SOD的提取与分离方法 2、掌握SOD活力测定NBT光化还原法的原理3 熟悉G-250法对蛋白浓度的测定以及PAGE电泳的操作方法2、 实验的原理1、通过研磨和高速离心的方法粗提大蒜SOD,再经过丙酮沉淀得到SOD酶液2、由于SOD是含金属辅基的酶，通过氮蓝四（NBT）光还原法测定酶的活性。NBT在蛋氨酸和核黄素存在的条件下，照光后发生光化还原反应而生成蓝色甲腙，在560nm处有最大光吸收。SOD能抑制NBT的光化还原，其抑制强度与酶活性在一定范围内成正比。3考马斯亮蓝G250与蛋白质通过疏水结合作用后，变为蓝色，在波长为595nm处测得吸光

2、度，用EXCEL软件得出标准曲线，从而得到待测的蛋白浓度。3、 实验的材料和试剂（1）新鲜蒜瓣；（2）磷酸buffer（0.05mol/L，pH7.8）；（3）氯仿：无水乙醇（3:5，V/V）；（4）丙酮，冷却至410四、实验步骤1、SOD的提取称取150g大蒜蒜瓣 2倍体积的0.05mol/L磷酸buffer pH7.8研磨继续研磨至浆状弃沉淀，取上清液（留34ml样用作分析）4800rpm，离心15min静置20min（使SOD充分溶解到buffer中）0.25倍体积的氯仿：乙醇混合溶剂2、 除杂蛋白搅拌15min上清液 离心（4800rpm，15min）去杂蛋白，得粗酶溶液（留2ml样用

3、作分析）粗酶液3、SOD的沉淀分离5560热处理15min，流水冷却溶于0.05mol/LpH7.8磷酸buffer（留2ml样用作分析） SOD沉淀离心，4800rpm，15min等体积冷丙酮 离心（4800rpm，15min） 弃沉淀，得到SOD酶液（留2ml样用作分析）5、 结果分析1、SOD活力测定NBT光化还原法试剂：（1）0.026mol/L蛋氨酸（Met）溶液；（2）75×10-5mol/L氯化硝基四氮唑蓝（NBT）溶液；（3）1.0mol/LEDTA及2×10-5mol/L核黄素溶液。表1 反应各系统中试剂用量（ml） 试剂杯号0.026mol/LMet缓冲

4、液75×10-5mol/LNBT1.0mol/LEDTA2×10-5mol/L核黄素酶液0.05mol/L磷酸缓冲液pH=7.811.50.30.300.921.50.30.300.931.50.30.300.941.50.30.310ul0.951.50.30.320ul0.961.50.30.350ul0.971.50.30.3100ul0.981.50.30.300.9试液全部加入后，充分混匀，除1号杯置于暗处外，其余均在25，光强为3000Lux的2盏20W日光灯下照光15分钟，然后立即遮光停止反应，于560nm以第一号杯调零，测定光密度。以2、3号杯液光密度的平均

5、值作为还原率100%，分别计算不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分率，作出二者相关曲线（以酶液用量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标），找出50%抑制的酶液量（l）作为一个酶活单位。结果计算：SOD活力按下式计算： V×1000×60A= B×W×T式中 A：酶活力（酶活力单位·g 1FW·h1）；V：酶提取液体积（ml）；B：一个酶活单位的酶液量（l）；W：样品鲜重（g）；T：反应时间（min）。图1 以酶液用量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标2、蛋白质浓度的测定-考马斯亮蓝G-250法考马斯

6、亮蓝G250在酸性溶液中呈棕褐色，它与蛋白质通过疏水结合作用后，变为蓝色，最大吸收光谱从470nm移至595nm，在一定条件下，蛋白质的浓度与595nm吸光度呈正比例。该法灵敏度在0.011.0g/ml。快速简便，但在不同蛋白质之间差异甚大，且标准曲线在高浓度时线性关系较差。1.试剂（1）标准蛋白液： 0.1mg/ml BSA贮液，以0.9%生理盐水配制。（2）蛋白质分析反应剂(Protein assay reagent)： 取0.1g之考马斯亮蓝 G-250溶于50 ml 95% 酒精中，完全溶解后加入100 ml之85%(w/v) 磷酸，最后将总体积以二次水补至1000ml。2.标准曲线制

7、作蛋白质定量测定标准曲线制作溶液0管1管2管3管4管5管留样1留样1系列标准蛋白液/ml0.20.40.60.81.011实际蛋白质含量/g204060801000.9%生理盐水/ml1.00.80.60.40.2-蛋白质染色液/ml5.05.05.05.05.05.05.05.0轻轻摇匀，5min后以0管调空白，595nm分光光度法测光密度值，绘出标准曲线。未知样品从标准曲线上查出相应浓度。图2根据得到的蛋白质曲线得到公式: y=0.0096x-0.0144 。3、SOD纯度的鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)1.试剂1.1凝胶贮备液和缓冲液配制见表。凝胶贮备液和缓冲液配制表贮备液名称100

8、ml中含量pH配制溶液时比例A1mo/LHCl 48ml8.9分离胶A：C：水：G=1：2：1：4凝胶浓度7.5% pH8.9 Tris 36gTEMED 0.24mlCAcr 30gBis 0.8gG过硫酸胺 0.14gB1mol/LHCl 48ml6.7浓缩胶B：D：E：F=1：2：1：4凝胶浓度 2.5% pH6.7Tris 5.9gTEMED 0.46mlDAcr 10gBis 2.5gE核黄素 4mgF蔗糖 40g电极缓冲液Tris 6g 甘氨酸 28.8 水定容至 1000ml8.3使用时稀释10倍1.2 0.1%溴酚蓝指示剂。1.3染色液(0.05%考马斯亮蓝R250的20%磺基

9、水杨酸染色液)考马斯亮蓝0.05g，磺基水杨酸20g，加蒸馏水至100mL，过滤后置试剂瓶内保存。1.4脱色液 7%乙酸溶液。1.5保存液 甘油10mL，冰乙酸7mL，加蒸馏水至100mL。1.6 1%琼脂(糖)溶液 琼脂(糖)1g，加已稀释10倍的电极冲液，加热溶解，4贮藏，备用。2.操作2.1安装垂直板电泳糟 按照说明书操作。2.2制备凝胶板PAGE有连续体系与不连续体系2种，其灌胶方式不完全相同，分别叙述如下：（1）连续体系本实验采用28Acr-0.735Bis凝胶贮液。从冰箱取出各种贮液，平衡至室温后，按表的配比即(1)：(2A)：H2O：(3)=l：2：1：4配制20mL 7.0凝胶

10、。前3种溶液混合在小烧杯内，(3)号液单独置另一小烧杯，二者抽气后轻轻混匀，立即用细长头的滴管将分离胶溶液加到凝胶模长、短玻璃板间的狭缝内，当加至距短玻璃板上缘约0.5cm时，停止加胶，轻轻将样品槽模板插入。在上、下贮槽中倒入蒸馏水，液面不能超过上贮槽的短玻璃板，防止蒸馏水进入凝胶中。其作用是增加压力，防止凝胶液渗漏。凝胶液在混合后15min开始聚合，约0.51h，完成聚合作用。聚合后，在样品槽模板梳齿下缘与凝胶界面间折射率不同的透明带。看到透明带后继续放置30min再用双手取样品槽模板。取时动作要轻，用力均匀，以防弄破加样凹曹。凹槽中残留液体可用窄滤纸条轻轻吸去，切勿插进凝胶中，应保持加样槽

11、凹边缘平整。放掉上、下贮槽中的蒸馏水。在上、下两个电极槽倒入电极缓冲液，液面应没过短玻璃板上缘约0.5cm。也可以先加电极缓冲液，然后拔出样品槽模板。分离胶预电泳：虽然凝胶90以上聚合，但仍有一些残留物存在，特别是AP可引起某些样品(如酶)钝化或引起人为的效应，因此在正式电泳前，先用电泳的办法除去残留物，这称为预电泳是否进行预电泳则取决于样品的性质。一般预电泳电流为10mA，60min左右即可。2.4电泳打开电泳仪开关，开始时将电压调至80V。待样品进入分离胶时，将电压调至100V。电泳结束时，用不锈钢铲轻轻将一块玻璃板橇开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿。2.5固定、染色

12、木实验采用0.05考马斯亮蓝R250(内含20磷基水杨酸)染色液，染色与固定同时进行，染色液没过胶板，染色30min左右。2.6脱色用7乙酸浸泡漂洗数次，直至背景蓝色褪去。如用50水浴或脱色摇床，则可缩短脱色时间。PAGE电泳结果如下： 离液3离液1离液2六、总结：1、在大蒜SOD的提取与分离过程中：大蒜很难磨碎，最好改用液氮研磨，有利于保存酶的活性。在加入氯仿离心后，提取粗酶溶液时，注意溶液里面在上层清夜下还有一层分层的溶液是不需要的。在加入氯仿混合液时，注意要轻轻搅拌，防止局部过热，影响酶活性。此外实验工具的不精确性可能导致了很大的误差的出现，包括：没有完全干燥的试管和各试管中反映不充分。2、 在测定