体外循环对中性粒细胞膜结合弹性蛋白酶的影响

1、体外循环对中性粒细胞膜结合弹性蛋白酶的影响作者：王维俊，汤敏，Gu,陈长志【关键词】体外循环【摘要】 目的探索体外循环前后膜结合弹性蛋白酶（MBE动力学变化，及MBE与术后炎性反应及组织功能之间可能存在的。方法连续收集10例体外循环下冠状动脉搭桥手术病人的资料，血样采集时间为开胸前、主动脉开 放后、体外循环结束时、停机后 3h和6h、术后第一天。分离血样中的中性粒细 胞，使用底物分析法测定被分离的中性粒细胞的MBE通过常规实验方法测定炎性反应和组织功能的生化标记物。结果开放主动脉后，MBE空度升高，停机时达峰值，在术后第一天恢复到术前水平。与主动脉开放后中性粒细胞在肺内滞 留相比，左房与右房血

2、中的 MBE没有差异。MBE或MBE总活性与术后炎性反应标 记物如C反应蛋白（CRP及组织功能标记物如乳酸、肌酸磷酸激酶（CPK、丙 氨酸氨基转移酶之间均无相关关系。结论体外循环促使中性粒细胞MBE表达，并在停机时达高峰，但与体外循环后炎性反应和组织功能的生化标记物之间没有 特定关联，提示体外循环中还有其他重要机制参与了术后炎性反应和器官功能障 碍的发生。【关键词】体外循环；中性粒细胞膜结合弹性蛋白酶Effect of CPB on membra ne-bo und elastase of n eutrophils【Abstract 】 Objective To study the effec

3、t of cardiopulmonary bypass （CPE、on the kinetic change of membrane-boundelastase （MBE and its possible link to the postoperative in flammati on and orga nTenconsecutive patients undergone elective coronary bypass surgery with CPB were recruited in the samples were taken before median sternotomy,afte

4、r aortic declmp in g,at the end of CPB,3h and 6h after CPB and on the first postoperative day was determined by substrate assay from isolated and organ function markers were determined with routine laboratoryMBEslightly in creased after aortic declamp in g,reached to its peak at the end of CPB,and r

5、eturned to its preoperative level on the first postoperative con trast to lung sequestrati on of n eutrophil coun t,there were no transpulmonary gradient of MBEbetween left and right atrium after aorticMBE nor total MBE activity was positively correlated with the postoperative in flammatio n markers

6、 such as blood lactate and C-reactive prote in and orga n function markers such as creati ne phosphok in ase and ala nineCPB in duces MBEexpressio n on n eutrophils with its peak at theend of of associati on betwee n n eutrophil MBE and cli ni cal markers suggests that multiple systems are invoIved

7、in the post-CPB inflammatory resp onse and orga n dysfu nction.【Key words 】cardiopulm onary bypass;membra ne-bo und elastase ofn eutrophils体外循环（CPB能通过激活循环中细胞与体液成分，引起全身炎性反应综合征1，2。激活的中性粒细胞释放出的弹性蛋白酶，被认为是能够降解各种 蛋白如弹性蛋白、纤维蛋白、糖蛋白等强有力的蛋白水解酶之一3。心内直视 手术的病人在转流中和转流后，中性粒细胞均能释放弹性蛋白酶47,但游离弹性蛋白酶能被体内广泛存在的蛋白水解酶抑制剂（p

8、rotease in hibitor,PI ）迅速结合而失去活性8。最近发现，中性粒细胞膜结合弹性蛋白酶（membranebound elastase,MBE ）能抵抗血浆和组织中蛋白水解酶抑制因子的作用9,而 且结合于中性粒细胞膜上的弹性蛋白酶，在攻击血管内皮细胞和引起组织损伤方 面，较血浆中游离的弹性蛋白酶具有更强的生物活性1012。本研究的目的 就是研究心脏手术病人在转流中和转流后MBE的动力学变化，并试图寻找其与术后炎性反应及组织功能变化之间的关系。1 资料与方法一般资料20XX年11月1日20XX年11月30日，连续10例行择期冠脉搭桥术患者。术前排除标准：（1）存在感染；（2）全血

9、白细胞总数10000/卩l ;（3）中性粒细胞计数7000/卩l ; （4）红细胞沉降率20mm/h （5） C反应蛋白（CRP 8mg/L。病人的一般资料见表1。血样采集和临床数据收集于开胸前5min （T0）、体外循环结束时（T3）以及术后第一天8Am（T4）分别抽取桡动脉血15ml,并在主动脉开放后10min从 左房（T1）和右房（T2）各抽血15ml。10ml全血用Na2EDT溶液抗凝后测定 MBE 余5ml送检中性粒细胞计数、血淀粉酶、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、肌酸磷酸激酶（CPK和CRP表1一般资料（略）临床血流动力学和呼吸参数分别于术前 5min、停机时、停机后3h和6h以 及

10、术后第一天8Am收集。血流动力学参数包括心率(HR)、平均动脉血压(MAP、 左房压(LAF)和中心静脉压(CVP；呼吸功能参数包括肺顺应性(lung pliance,LC ) 和弹性气道阻力rway resistance,AR )。MBE测定中性粒细胞分离10ml全血在4C下以1500rpm离心10min,收集上层血浆置于-20C 保存。细胞成分用 PBS液 (phosphate buffer solutio n,PBS)按1 ：1比例稀释后待用。将4ml密度为/ml的74%NaC溶液注入一个14ml的 聚苯乙烯试管，在其上层小心覆盖 4ml密度为/ml的55%NaC溶液，将4ml稀 释后的

11、血样覆盖在最上层。于 4C下以350Xg离心20min后，中性粒细胞聚集 于两层不同浓度的Percoll溶液之间。用吸管收集中性粒细胞，加入 4C PBS液 洗涤2次，以350Xg离心15min后，加入低渗溶液(NH4CI%Na2EDTA,%KHCO3 在室温下孵育5min,溶解残留的红细胞。以160Xg离心5min,用PBS洗涤后收 集中性粒细胞并计数。经Giemsa染色后检查中性粒细胞的纯度，发现纯度95% 经苔盼蓝(浓度)排除法检查细胞活力，证明活度95% 13。中性粒细胞膜结合弹性蛋白酶的检测将分离、收集的中性粒细胞与含有3%(W/V聚甲醛和1%X二醛的PBS液在4C下混合3min,以

12、PBS液洗涤2 次，再次计数并用PBS液稀释至中性粒细胞浓度为 2X 106/ml，已证明此固定法 对MBE勺活性没有影响9。MBE舌性通过底物分析法测定：取 50卩l中性粒细 胞稀释液，加入150卩l多肽底物溶液(1mM N-succinyl-(L-alanine)3-p-nitroanilide,200mMTris-HCI,pH=,Sigma,USA )，37C下孵育 60min 后加入5卩l冰醋酸结束反应。在405nm下比色，通过不同浓度的标准弹性蛋白酶溶 液(Sigma,USA、与底物反应的关系曲线得出 MBE舌性，此分析法的敏感度可达 /106中性粒细胞。使用下列公式将测得值转换成中

13、性粒细胞MBE总活性。MBE总活性(ng/ml ) =MBE( ng/106 )X 中性粒细胞数量(106/ml)统计学方法使用成对t检验法检验各时刻间实验室和临床数据有无差异，使用Pearson相关分析检验临床与实验室指标间关系，数据用平均值加减标准差表示，P示统计学差异显著。2 结果10例患者转流时间平均(124 35) min,主动脉阻断时间平均(86 27) min。 术后多巴胺最大剂量为(土)卩g/kg，肾上腺素最大剂量平均(土)卩g/kg，术后 第一天8Am前外科引流量平均为(612 300) ml，尿量平均为(116 40) ml/h, 病人均康复出院，平均住院(土)天，无明显的

14、感染、围手术期心梗或外科出血。中性粒细胞计数术前中性粒细胞计数为(3720 10)X 106/L，主动脉开放后10min,右房中性粒细胞计数上升至(4950 1964)X 106/L (Pv)。右 房与左房中性粒细胞计数差异有显著性，分别为 （4950 1964）X 106/L及 （3600 1761）X 106/L （Pv）。体外循环结束以及术后第一天，中性粒细胞计数 分别为（9920 4081）X 106/L （ Pv）及（15340 31）X 106/L （ Pv）。MBE活性和MBE总活性（表2） 术前MBE舌性为（） ng/106中性粒 细胞。主动脉开放后10min,右房和左房内MB

15、E分别增加至（161 120） ng/106 及（） ng/106，但与术前相比统计学无显著差异。体外循环结束时，MBE较术前明显增高，达（土）n g/106 （Pv）,术后第一天MBE值低于术前水平（土）ng/106 ， 但与术前差异无显著性。MBE总活性受中性粒细胞数量影响较大，主动脉开放后 右房与左房内MBE总活性分别为（854700） ng/ml和（土）ng/ml，与术前相 比无明显差异，心房间差别也不显著（P=）。体外循环结束时MBE总活性较术前 明显升高，分别为（土） ng/ml及（土）ng/ml （Pv）。术后第一天，MBE总活性 比术前明显升高，达（土） ng/ml （Pv）。

16、表2 MBE及MBE总活性变化（略）注：与术前比较采用成对t检验*Pv，*P v组织功能、生化指标、血流动力学及呼吸动力学变化见表3。术后第一天，CPK血淀粉酶较术前显著升高（Pv），术后第一天CRP较术前差异有 非常显著性（土）mg/L及（土）mg/L，（P）。术后第一天血糖水平较体外循 环结束时及术后3h均明显增加（Pv）。血乳酸水平于体外循环后及术后第一天 较术前明显增加（Pv）。表3 血流动力学、血液生化检查（略）注：ND:未检测；与术前比较采用成对t检验*Pv，*P v平均动脉压和左房压在体外循环前后差异无显著性。体外循环结束后6h的气道阻力明显低于停机后3h。肺顺应性在停机后3h和

17、6h没有明显差别。使 用Pearson相关分析，各时刻MBE总活性和MBE呈正相关（Pv）,未见MB或MBE 总活性与组织功能、生化指标、临床血流动力学或呼吸功能参数之间有相关关系。3 讨论在体外循环中或结束后所释放的炎性介质中，被激活的中性粒细胞所释放 的弹性蛋白酶能作用于不同的蛋白底物， 它是最强的蛋白水解酶之一。这种酶储 存于中性粒细胞的胞浆颗粒中，体外循环中许多因素诸如肝素抗凝、温度改变、 缺血再灌注等都可以激活中性粒细胞，并促使其释放弹性蛋白酶和氧自由基等毒 性物质对组织造成损伤1416。但体内存在大量血浆型或组织型蛋白水解酶 抑制剂（PI ），中性粒细胞释放到血液或组织中游离的弹性

18、蛋白酶与之结合后，其降解蛋白的作用将被抑制。体外循环中血浆弹性蛋白酶与蛋白酶抑制剂复 合物在体外循环后数小时内达到高峰，并在术后 1周仍保持较高水平17。膜 结合弹性蛋白酶失去蛋白酶抑制剂结合位点，因此它的活性不受抑制剂的影响， 从而能发挥其降解作用9。多种细胞因子、内毒素等能诱导中性粒细胞表达膜 结合弹性蛋白酶911。当激活的白细胞与血管内皮细胞黏附时， MBE从中性 粒细胞膜上不同部位向中性粒细胞与内皮细胞结合处转移，继而水解内皮细胞间的连接蛋白，有助于中性粒细胞完成向血管外的“游走过程”，这一机制已被体外趋化实验模型所证实10, 12。因此，MBE在中性粒细胞的出血管过程和组 织消化过程

19、中起重要作用，但其在体外循环前后的动力学变化及作用机制仍不为 人们所知。本研究中，我们观察到从体外循环开始至升主动脉开放前，MB0保持在较低水平，体外循环结束时，MBE快速达到高峰，在术后第一天，又回到术前水平。 与血浆中弹性蛋白酶-PI复合物的动力学相比，MBE变化时间短，上升和下降的 速率快，这一特点使之能更敏感地反映体外循环对中性粒细胞的影响。体外循环后，大量白细胞从骨髓和边缘池进入血循环， 但MBE在术后第一天即回至术前水 平，说明新释放的白细胞没有 MBE异常表达（图1,表4）。图1 体外循环前后体循环中性粒细胞数量和MBE舌性的动态变化（略）T0:手术前；T1:主动脉开放后10mi

20、n； T2:体外循环结束；T3:手术后 第一天。 使用配对t检验与T0时刻比较*P，*P表4 体外循环前后体循环中性粒细胞数量和 MBE活性的动态变化 （略）肺对白细胞的扣押是体外循环激活白细胞后的现象18。文献显示，开放主动脉后，左房内氧自由基浓度较右房高，提示肺血管参与了中性粒细胞的激活18。本研究中，我们曾假设左房内 MBE舌性比右房高，然而，结果显示在左 房和右房内的MBE舌性没有差别，这提示肺在诱导MBE表达方面作用甚微（图2, 表5）图2 主动脉钳开放后10min左房和右房中性粒细胞数量和 MBE舌性（略） RA:右房；LA:左房。右房和左房差异使用配对t检验，*P 表5 主动脉钳

21、开放后10mins左房和右房中性粒细胞数量和 MBE舌性 （略）与MBE相比，MBE总活性真正反映了体内 MBE总量。基于上述 MBE在中性 粒细胞的出血管过程和组织消化过程中所起的重要作用，MBE总活性的改变应与组织损伤生化标记物、器官功能参数变化相一致，MBE总活性减少应伴随诸如C反应蛋白、肌酸磷酸激酶、血淀粉酶等生化标记物的减少及心、肺功能参数趋向好转，但在本研究中未发现这种紧密相关关系。这提示在体外循环导致的炎性反应和组织损伤中，除膜弹性蛋白酶外，尚有其他重要机制参与了这一过程。4 结论体外循环可诱导中性粒细胞膜上的MBE表达增加，MBE变化时间短，上升和下降的速率快，能更敏感反映体外

22、循环对中性粒细胞的影响。经过肺循环的中性粒细胞，其膜上MBE勺表达没有改变，提示肺在诱导 MBE表达方面作用甚微。 MBE在中性粒细胞的出血管过程和组织消化过程中起着重要作用，但MBE和 MBE总活性与CRP等无明显相关，提示在体外循环导致的炎性反应和组织损伤中，除 膜弹性蛋白酶外，尚有其他重要机制参与了这一过程。【参考文献】1 Kirklin JK, Westaby S, Blackst one EH,et al. Compleme nt andthe damaging effects of cardiopulmonary bypass. J Thorac Cardiovasc Surg，

23、1983, 86:845-857.2 Westaby S. Orga n dysf un cti on after cardiopul monary bypass. Asystemic in flammatory react ion in itiated bythe extracorporeal circuit.Intens Care Med ， 1987， 13:89-95.3 Weissma nn G, Smole n JE, Korchak HM. Release of in flammatorymediators from stimulated neutrophils.NewEngl

24、J Med, 1980，303:27-34.4 Hashimoto K, Miyamoto H,Suzuki K, et al. Evidenee of organ damage after cardiopul monary bypass. The role of elastase and vasoactivemediators. J Thorac Cardiovasc Surg ， 1992， 104:666-673.5 Butler J, Pillai R, Rocker GM,et al. Effect of cardiopulmonary bypass on systemic rele

25、ase of n eutrophil elastase and tumor n ecrosisfactor. J Thorac Cardiovasc Surg,1993,105:25-30.6 Schwartz JD, Shamamia n P, Schwartz DS, et al. Cardiopul monary bypass primes polymorphonuclear leukocytes. J Surg Res,1998,75:177-182.7 Faymonville ME, Pincemail J, Duchateau J, et al. Myeloperoxidase a

26、nd elastase as markers of leukocyte activati on duri ng cardiopulm onary bypass. J Thorac Cardiovasc Surg,1991,102:309-317.8 Travis J. Structure, fun cti on, and con trol of n eutrophilprotei nase. Am J Med,1998,84:37-42.9 Owen CA, Campbell MA, Sa nnes PL, et al. Cell surface-bou nd elastase and cat

27、eps in G on huma n n eutrophils: a no vel, non-oxidative mecha nism by which n eutrophils focus and preserve catalytic activity of serine protei nases. J Cell Biology,1995,131:775-789.10 Cep in skas G, San dig M, Kvietys PR. PAF-i nducedelastase-depe ndent n eutrophil transen dothelial migrati on is

28、 associatedwith the mobilizati on of elastase to the n eutrophil surface and localization to migratio n front. J Cell Sci,1999,112:1937-1945.11 Owen CA, Campbell MA, Boukedes SS, et al. Cytoki nes regulate membra ne-bo und leukocyte elastase on n eutrophils:a no vel mecha nism for effector activity. Am J Physiol,1997,272:385-3.12 Herma nt B, Bibert S, Co ncord E, et al. Ide ntificatio n ofproteases invo Ived in the proteolysis of vascular en dothelium cadheri n during neutrophil Biol Chem,20XX,278:14002-14012.13 Hjorth R, Jon sson AK, Vretblad P. A rapid method forpurificationof h