第四章人工染色体载体

1、第4章人工染色体载体黏粒载体酵母人工染色体载体细菌人工染色体载体P1噬菌体载体和P1人工染色体载体表4-1 5种常见高容量克隆载体及其基本特性载体容量（kb）复制子宿主拷贝数重组DN导入 宿主的方式筛选标记克隆DNA 获取方法黏粒30-45ColE1大肠杆菌高转导碱抽提P170-100P1大肠杆菌1转导sacBPAC130-150P1大肠杆菌1电转化sacBBAC120-300F大肠杆菌1电转化a -互补YAC250-400ARS酵母菌1转化ade2脉冲场电 泳4.1黏粒载体4.1.1黏粒的结构特征和用途o黏粒（cosmid ）是质粒的衍生物，是带有 cos序 列的质粒。cos序列是入噬菌体D

2、NA中将DNA包装 到噬菌体颗粒中所需的 DNA序列。o黏粒的组成包括质粒复制起点（ColEI）、抗性标记（ampr）、cos位点，因而能像质粒一样转 化和增殖。o它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段 DNA克隆的最大DNA片段可达45kb。4.1.2黏粒载体的工作原理* PJ42 EJ.电图4-1黏粒载体克隆DNA勺一般原 理和步 骤cm4.1.3黏粒克隆载体1.黏粒pJB8o大小为5.4kb，由 amp, ColEI 复制 起点（ori ）, cos位点，多克隆 位点组成，可容 纳33-46.5kb外源 DN循段，主要用 来在细菌中克隆 真核DNAluUL5 4KR1I护咚IMlMl

3、l2 i:mi2.含双cos位点的黏粒载体c2RB和 Supercos-1 是 含双cos位点的 黏粒载体，c2RB大小为6.8kb ,含两个 cos位点，在 cos位点之间有Karf （图 4-3 ） 装载容量33-禺I46.5kb图4-4Supercos-1 克隆 的原理和步骤o Supercos-1 大小为 7.94kb ,含 有在真核细 胞中起作用 的来自猿猴 病毒SV40勺 复制起点ori -SV40和 新霉素抗性 基因I(khl克隆勒让bl餡RMEI5芒A Tip! KinBamH11 G：e h EccR：，H in HI PM SmeJ32-4?PHC7&MDI5dAmp- b

4、Tct1EcoRI H:ntiIIL 囱1 ：,BatnHl 用 tl, Cdl阴一巧:CulEl2dK*BflmHl,EccKL.?incll諒70pK74Col El15-8Amp?EccRI,BamHhJ5flH2L-J7pJC/a-lSCoJElIblAmt：EcRLBaiuHIIIP.ICZkmColElJIAtnp.KmrSiuHIizrpJTvznCnlEl也須血,RiFHihdll,XmAlPJC81pFZEI?” LAjiyp 订 T亡Kpn【,Ete eHI - HindnL !nj1 I眈昴订陥Cui El5.1AniBncuHItHiudnillir-47MuA-dpM

5、B讥T”Pst 1, EccRI. Ball, P.ul r ?vullMiA KdkbiTit7EcDRr&iPYiiIfFvunf-TL5pKDITrlU，BilLHpaIpVF?pMBI5-iAmpcEccRLSaLI炉-&4.1.4黏粒的优缺点(1) 同时具有入噬菌体和质粒载体的特性(2) 具有高容量的克隆能力柯斯质粒的缺点o两个粘粒之间，当存在同源序列时，可能会发生 重组，结果使克隆的外源DN循段重排或丢失。o含不同重组DNA勺菌落生长速度不一。当柯斯质 粒文库复制扩增时，由于不同的插入片段对宿主 细胞作用的情况不同，结果会出现各种 外源DNA 片段间的比例失调。另外不同重组柯斯质粒

6、的产 量相差悬殊。o包装蛋白制备过程较复杂，每批包装蛋白的包装 效率不稳定。而且，购买包装蛋白的费用较高。4.2酵母人工染色休载休o YAC (Yeast Artificial Chromosome)酵母人工染色体o 利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )的染 色体的复制 元件构建的载体，其工作环境也是在酿 酒酵母中。o酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为90 分钟；含16条染色体，其大小为225-1900kb，总计 有14 X 106bp;具真核mRN的加工活性。4.2.1 YAC载体的复制元件和标记基因o最常用的是pYAC4o由于酵母的染色体是 线状的，因

7、此其在工作状 态也是线状的。但是，为了方便制备YAC载体， YAC载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠 杆菌质粒载体的复制 元件和选择标记。o YAC载体的复制 元件是其核心组成成分，其在酵 母中复制的必需兀件包括复制起点序列 即自主 复制序歹 U (aut onom ously replicat ing sequenee, ARS、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒(centromere, CEN)和 两个端粒 (TEL)。YA（载体必须含有元件 端粒重复序列 （telomeric repeat , TEL）,定 位于染色体末端一段序列，用 于保护线状 的DNA不 被胞内的核酸酶降解，以形

8、成稳定的结构。 着丝粒（centromere ， CEN ，有 丝分裂 过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在 分裂过程中能正 确分配到子细胞中。在YAO中起到保证一个细胞内 只有一个人工染色体的作用。如pY AC使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。 自主复制序列 （autonomously replicationsequences，ARS 一段特 殊的序列，含有酵母菌 中DNA进行双向 复制所必须的信号。YAC载体的选择标记o主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组 氨酸合成缺陷型基因trp 1、leu 2和his 3、尿嘧啶合 成缺陷型基因ura3等，以及赭石突变（突变为 UAA 抑制基因s

9、up4。o与YAC载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的 胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2-1。带有 这个突变的酵母菌在基本培养基 上形成红色菌落， 当带有赭石突变抑 制基因sup4的载体存在于细胞中 时，可抑制ade2-1基因的突变效应，形成正常的白 色菌落。o 利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中 含有外源DNA片段插入的重组子。422 YAC载体的工作原理o YA（载体主要是用来构 建大片段DNA文库，特别 用来构建高等真核生物的 基因组文库。9#APrCla I (25)CEN4Hin dill (30)EcoRI (555)Sma I (592)Hin dIII

10、 (9630)TRP1URA3Xbal (9201)PMB1Clal (4307)BamHI (6006)Hin dlll (5045)ARS1pYAC411454bpSalI (944)XhoI (6711)Hi ndlll (6701)BamHI (4238)10HIS3Hi ndlll (5232)#4.2.2 YAC载体的工作原理o YA（载体主要是用来构 建大片段DN应库，特别 用来构建高等真核生物的 基因组文库。Cla I (25)CEN4Hindlll (30)EcoRI (555)ARS1Sma I (592)Hin dill (9630)Sall (944)TRP1Xbal

11、(9201)URA3pYAC411454 bp APrXhol (3533)PMB1Xhol (6711)Hindlll (6701)TELBam HI (6006)Hindlll (3543)TELBamHI (4238)Clal (4307)Hindlll (5045)HIS3Hindlll (5232)84.3.1 BAC载体及其结构组成o约7.5kb ,其本质实际上是一个质粒克隆载体。o复制单元的特殊性:来自F质粒，包括严谨型控 制的复制区oriS，启动DNA复制的由ATP驱动的 解旋酶（RepE以及3个确保低拷贝质粒精确分 配至子代细胞的基因座（parA、parB和parCo低拷贝性

12、可以减小外源基因的表达产物对宿主 细胞的毒副作用。o标记基因:氯霉素抗性基因o BA（与 YAC和PAC相似，没有包装限制，因此可接受 的基因组DNAt小也没有固定的限制。o大多数BAC文库中克隆的平均大小约120kb，个别的 BAC8组子中含有的基因组DNA最大可达300kb。114.4 P1噬菌体载体和P1人工染色 体载体441 P1噬菌体载体的分子遗传特征o P1噬菌体感染性颗粒中的噬菌体 基因组为双链 线状DNA大小约为110 kb，两端各有约10 kb 的末端冗余序列。o当噬菌体基因组进入宿主细胞后，在冗余序列 之间发生重组，形成环状基因组。o其后噬菌体由c I基因调节进入溶原或裂解

13、状态121.裂解生长和噬菌体的包装o当CI阻遏物浓度不足以维持溶原状态时，噬菌 体进入裂解生长状态。此时噬菌体基因组通过 裂解性复制子进行0复制，继而转为滚环复 制，产生头尾相连的基因组多联体。该多联体 可作为噬菌体颗粒包装的 底物。o由于基因组的大小是90 kb，多联体的重复间距 是90 kb，而包装的大小却为100 kb，因此，被 包装的DNA中除了基因组DNA外还有末端冗余， 而且在同一个多联体中被包装的DNA片段的末端 都是不一样的，在噬菌体颗粒中 基因组的基因 是循环排列的。o包装从多联 体一端的 pac位点开 始，每100 kb被包装到 噬菌体颗粒 中去，一个 多联体可供 包装大约

14、4 个噬菌体。I船血闻轴IIIIIr- FaSHEAfDNA灼1如小131.裂解生长和噬菌体的包装#1.裂解生长和噬菌体的包装图4-8 P1 噬菌体DNA多联体的包装#1. P1噬菌体载体的 组成o P1噬菌体DNA在环化以后进入溶原状态，但其前 噬菌体的存在与入前噬菌体的存在状态完全不同o入前噬菌体是整合到宿主的基因组中，而P1前噬 菌体却是以附加体的形式，就像质粒一样游离 于宿主的染色体 之外，以单拷贝质粒的形式进 行复制并分配到子细胞中去。o此时，除控制溶原状态的c I等少数基因表达 夕卜，P1噬菌体中的 绝大多数处于沉默状态。442 P1噬菌体载体o与黏粒载体工作原理 比较相似的一种高

15、容量载 体。o它含有很多P1噬菌体的顺式作用元件，能容纳 70-100kb大小的 基因组DNA片段。pAdlOsacB n组成可 分为以下几个部分： 复制元件：质粒复制子和裂解性复制子环化和包装信号：2个loxP重组位点和包装识 别位点pac,用于体外包装 标记基因：kanr;果聚糖蔗糖酶基因sacB，含 sacB的大肠杆菌在蔗糖培养基上不能存活，用于 插入失活筛选重组子。克隆位点：sacB内部 填充片段：11kb腺病毒，作为填充物弥补外 源DNAt段长度。152. P1噬菌体载体的 工作原理o用Seal将P1噬菌体载体 切成线状，再用BanHI 消化，同时基 因组DNASSau3A I或Mo

16、bI部分酶 切，回收70-100 kb的酶切片段。o将酶切片段与酶切后的载体连接，然后用P1噬 菌体包装蛋白进行包装，再感染大肠杆菌。o重组DNAt射到Cre重组酶的大肠杆菌中，线状 DNA分子通过重组于载体的两个loxP位点之间的 重组而发生环化。o将感染的细胞置于含卡那霉素和5%蔗糖的培养 基上筛选，只有含载体分子且sacB基因中插入 了外源片段的细胞才能生长。（插入失活）16443 P1人工染色体载体（PAC）o P1 人工染色体（P1 Artificial Chromosome , PAC载体结合了 P1载体和BA（载体的最佳特 性，相当于P1噬菌体载体的 改进载体。o 载体 pCYPAC 1（图 4-11），与pAdlOsacBII 相 比，去掉了填充片段和pac位点，而且loxP重组 位点只保留一个。o用这样的载体构 建基因文库时，重组分子不能 通过体外包装来 感染宿主细胞，而只能通过电 转化来将重组分子导入宿主细胞。氐帀i