受体研究方法

1、受体概论之受体研究方法 2二、受体研究的内容* 受体与配基的相互作用；* 受体的激活机制；* 后 续信号转导的启动机制；* 信号转导的路径；* 引起相应的生物学效应。3三、受体与配基结合反应的基本特征*可饱和性 细胞特定的受体，数量有限。*可逆性 内 解离；外 可逆和不可逆*特异性和亲和力 配基、组织或器官特异*和生物学效应相关 4四、受体研究的意义* 受体是调节细胞功能的有高度特异性的“门户”，而细胞功能的改变是乃许多疾病的基础，因此研究受体结构功能的改变和各种重要疾病发病机制的关系受到高度重视；5* 寻找有高度选择性的药物一直是科学家的追求目标，受体的激动剂、拮抗剂以及调节受体结构和功能的

2、药物正是这方面极有前途的研究对象。6* * 从更深层次上看，受体和配给的从更深层次上看，受体和配给的结合属于研究蛋白质三维结构的结合属于研究蛋白质三维结构的重要内容，在分重要内容，在分子子生物学已进入生物学已进入后基因组时代的今天，这方面的后基因组时代的今天，这方面的研究有很重要的理论意义。研究有很重要的理论意义。第一节第一节 受体的放射配基结合分析受体的放射配基结合分析8第一节第一节 基本原理基本原理20世纪20年代末A.J.Clark发现药物效应与受体结合量呈正比且药物活性与受体亲和性有关。9提出占领理论：受体与配基以单分子相互作用（分子比1：1），结核反应是可逆的，亲和性相同，配基在结合

3、和解离后不被代谢，也不与其它类型受体结合，受体与配基结合产生的生物效应的强度与受体被占领的量成正比，受体结合反应平衡后服从质量作用定律。1020世纪60年代初建立受体放射配基结合分 析（Radioligand Binding Assay of Receptors, RBA） 方法11受体放射配基结合分析法一、放射性配基的制备 *对放射性配基的要求 ： 放射比活度高 亲和力高 特异性高 稳定性好 12125I标记放射性配基的制备（可查相关文献） 1 氯胺-T法，N-氯代甲苯磺酰胺钠盐 2 Iodogen法，商品名为氯甘脲 3 乳过氧化物酶法 4 偶联标记法，标记游离氨基13受体标本的制备1 组织

4、切片 新鲜组织冰冻切片-离体放射配基结合反应常规超薄切片电镜自显影2 完整活细胞 悬浮细胞：加入放射性配基进行结合反应，反应结束后取少量细胞，测量放射性。14贴壁细胞：待细胞长到90%左右去掉培养基，换为配基结合反应的缓冲液，不作成悬液，直接向贴壁细胞中加入放射性配基进行结合反应。 反应结束后，用冰冷的缓冲液洗去多余的游离配基，然后收集细胞，测定放射性。153 亚细胞组分的差速离心法分离 全过程在4C下进行。 组织匀浆上清液 上清液 上清液（核受体） （800-3500g，15分钟）-（10000-30000g，20min）-（100000g，60min） 注意问题： 除去内源性配基和蛋白水解

5、酶 受体标本保存，-70C保存 受体蛋白从从膜结构或核中溶脱成可溶性受体，洗涤或用溶脱buffer。 免疫组织化学免疫组织化学(immunohistochemistry)图图10 10 免疫组织化学原理模式图免疫组织化学原理模式图 抗原抗原 抗体抗体荧光素荧光素辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶胶体金胶体金图图11 11 免疫组织化学（荧光素标记）免疫组织化学（荧光素标记）毛细血管内皮细胞呈毛细血管内皮细胞呈vWFvWF阳性阳性 图图12 12 免疫组织化学（辣根过氧化物酶标记免疫组织化学（辣根过氧化物酶标记）胰岛胰岛B B细胞呈胰岛素阳性细胞呈胰岛素阳性图图13 13 免疫组织化学电镜免疫组织化学

6、电镜图图示上皮细胞膜示上皮细胞膜MAMMAM6 6蛋白蛋白 （A A 胶体金标记胶体金标记 B B 辣根过氧化物酶标记）辣根过氧化物酶标记）图图18 18 体外培养的平滑肌细胞体外培养的平滑肌细胞 （免疫组织化学染色显示肌动蛋白）（免疫组织化学染色显示肌动蛋白） 24抗原抗体反应是特异性最强的反应之一，免疫细胞化学所用的抗体必须是特异性强的多价或单价抗体，具有高度的认别能力，在抗原识别上可达到单个氨基酸的水平，这是其它组织化学方法难以相比的。252627缺点：无法测定受体配基反应的亲和性282930313233343536373839404142434445464748495051525354

7、555657585960616263646566676869707172737475767778798081828384858687888990 二、引起假阴性和假阳性结果的原因二、引起假阴性和假阳性结果的原因 133134原位杂交术原位杂交术（in situ hybridization） 即核酸分子杂交组织化学术，检测基因（即核酸分子杂交组织化学术，检测基因（DNA片段）的有无、基因的表达活性（片段）的有无、基因的表达活性（mRNA） 原理：用带标记物的已知碱基顺序的核酸探针原理：用带标记物的已知碱基顺序的核酸探针与细胞内待测核酸按碱基配对原则进行特异性与细胞内待测核酸按碱基配对原则进行特异

8、性原位结合（杂交），并通过对标记物的显示而原位结合（杂交），并通过对标记物的显示而获知待测核酸的有无及相对量获知待测核酸的有无及相对量 常用标记物：放射性核素、地高辛常用标记物：放射性核素、地高辛135 探针（probe） DNA或RNA片断（一般30-40bp） 组织穿透力强 标记：同位素（放射自显影） 地高辛图图14 14 原位杂交原位杂交 脐静脉内皮细胞呈心房钠尿肽阳性脐静脉内皮细胞呈心房钠尿肽阳性137放射自显影术（放射自显影术（autoradiography） 概念：通过活细胞对某种放射性物质的特异性概念：通过活细胞对某种放射性物质的特异性摄入，以显示该物质在组织和细胞内的分布、摄入

9、，以显示该物质在组织和细胞内的分布、含量和代谢过程，借以反映细胞的功能状态含量和代谢过程，借以反映细胞的功能状态 应用举例应用举例 用用3H标记的胸腺嘧啶核苷研究标记的胸腺嘧啶核苷研究DNA合成和细合成和细胞增殖状态胞增殖状态 用用125I 观察甲状腺滤泡内碘化部位观察甲状腺滤泡内碘化部位图图15 15 放射自显影放射自显影 示幽门部胃小凹底的干示幽门部胃小凹底的干细胞细胞 （3 3H H标记的胸腺嘧啶核标记的胸腺嘧啶核苷标记）苷标记）1393H的分辨率高，但放射自显影时间长，一般需几周或更长时间。32P能量最大，放射自显影时间短，需几天，但分辨率低。35S介于两者之间。1401. 18cm不

10、锈钢高压锅或不锈钢高压锅或 电炉或医用微波炉；电炉或医用微波炉；2. 水浴锅水浴锅 一一. 仪器设备仪器设备141二. 试剂 1. 0.2mol/L HCl：HCl 8.2ml，H20 定容定容0.5L。2. 0.1mol/L三乙醇胺三乙醇胺(pH8.0):三乙醇胺三乙醇胺 5.33ml，H20 定容定容0.4L。3. 0.5ml/L醋酸醋酸-2.5ml/L醋酸酐醋酸酐:三乙醇胺三乙醇胺 13.2ml，NaCl 5g，浓，浓HCl 4ml，H20 定容定容0.98L，醋酸，醋酸酐酐 （用（用前加）前加）2.5ml。4. 20SSC(pH7.0)：NaCl 175.3g，枸橼酸钠，枸橼酸钠 88

11、.2g，H20 定容定容1L。1425. 100Denhardts：Ficoll 1g，PVP 1g，BSA 1g，H20 定容定容50ml。6.杂交液：杂交液：Formamide 5ml，20SSC 2.5ml，Dextran sulfate 1g，100Denhardts 0.5ml，10%SDS 0.5ml，10g/L sperm DNA 0.1ml，H20 1.4L。7.Buffer（pH7.5）：）：0.1mol/L TrisCl，0.15mol/L NaCl。8.Buffer（pH9.5）：）：0.1mol/L TrisCl，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L MgCl

12、2。9.Buffer（pH8.0）：）：10mmol/L TrisCl，1mmol/L EDTA。 143 三三. 操作流程操作流程 第一天第一天1 1） 二甲苯于二甲苯于3737脱蜡脱蜡2 2次次, ,每次每次1515分钟；分钟；2 2） 无水乙醇浸泡无水乙醇浸泡2 2次，每次次，每次3 3分钟；分钟；3 3） 95%95%乙醇浸泡乙醇浸泡2 2次，每次次，每次3 3分钟；分钟；4 4） PBSPBS清洗清洗3 3分钟；分钟；5 5） 2%2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡焦碳酸二乙酯室温下浸泡1010分钟；分钟；6 6） PBSPBS清洗清洗1010分钟；分钟；1.1.使用地高辛标记使用地高辛标记

13、的核酸探针进行石蜡切片的的核酸探针进行石蜡切片的RNARNA原位杂交原位杂交1447 7） 加入胃蛋白酶加入胃蛋白酶25ul/ml25ul/ml，3737孵育孵育1515分钟；分钟；8 8） PBSPBS清洗清洗2 2次，每次次，每次3 3分钟；分钟；9 9） 0.2N0.2N的的HClHCl孵育孵育3030分钟；分钟；1010）PBSPBS清洗清洗2 2次，每次次，每次3 3分钟；分钟；1111）0.25%0.25%无水乙酸和无水乙酸和0.1M0.1M三乙醇胺孵育三乙醇胺孵育1010分钟分钟1212）PBSPBS清洗清洗2 2次，每次次，每次5 5分钟分钟1313）预杂交缓冲液孵育）预杂交缓

14、冲液孵育3030分钟分钟1414）准备核酸探针混合物）准备核酸探针混合物: :使用预杂交缓冲液稀使用预杂交缓冲液稀释探针，释探针，8585加热加热5 5分钟分钟, ,置于冰块中置于冰块中1010分钟分钟1515）杂交；）杂交；145第二天第二天1616）将玻片置于）将玻片置于SSCSSC中中2 2次，每次次，每次5 5分钟以分钟以去除封片；去除封片；1717）PBSPBS清洗清洗3 3分钟；分钟；1818）RNARNA酶酶A A溶液中（或溶液中（或0.1-1ng/mlPBS0.1-1ng/mlPBS中）中） 3737孵育孵育3030分钟；分钟；1919）PBSPBS清洗清洗5 5分钟；分钟；2

15、020）室温，）室温，2 2SSCSSC清洗清洗1010分钟；分钟；2121）3737，1 1SSCSSC清洗清洗1010分钟；分钟；2222）3737，0.50.5SSCSSC清洗清洗1010分钟；分钟；2323）缓冲液）缓冲液A A孵育孵育1010分钟分钟1462424）缓冲液）缓冲液A A（1%1%正常绵羊血清和正常绵羊血清和0.03%0.03%三重氢核三重氢核X-X-100100）孵育）孵育3030分钟；分钟；2525）加入抗地高辛抗体（）加入抗地高辛抗体（1/2001/200的上述缓冲液，来自的上述缓冲液，来自Boehringer MannheimBoehringer Mannhei

16、m），），3737孵育孵育3 3 小时；小时；2626）缓冲液）缓冲液A A清洗清洗2 2次，每次次，每次1010分钟；分钟；2727）缓冲液）缓冲液B B清洗清洗2 2次，每次次，每次5 5分钟；分钟；2828）制成）制成NBT/BCIPNBT/BCIP暗处保存暗处保存30-6030-60分钟，显微镜下进分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到1616小小时；时；2929）停止缓冲液）停止缓冲液B B的反应，用水进行简单的清洗；的反应，用水进行简单的清洗；3030）固红，脱水以及封片进行核的复染。）固红，脱水以及封片进行核的复染。147第一

17、天第一天1） 二甲苯于二甲苯于37脱蜡脱蜡2次，每次次，每次15分钟；分钟；2） 无水乙醇浸泡无水乙醇浸泡2次，每次次，每次5分钟；分钟；3） 95%乙醇浸泡乙醇浸泡2次，每次次，每次5分钟；分钟；4） PBS清洗清洗5分钟；分钟；5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；分钟；6） PBS清洗清洗5分钟；分钟；2 2、使用地高辛标记、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNADNA杂交杂交148 7 7） 加入胃蛋白酶加入胃蛋白酶25ul/ml25ul/ml，3737孵育孵育1010分钟；分钟；8 8） PBSPBS清洗清洗2

18、2次，每次次，每次5 5分钟；分钟；9 9） 0.2N0.2N的的HClHCl孵育孵育3030分钟；分钟；1010）PBSPBS清洗清洗2 2次，每次次，每次5 5分钟；分钟；1111）0.25%0.25%无水乙酸和无水乙酸和0.1M0.1M三乙醇胺孵育三乙醇胺孵育1010分钟；分钟；1212）PBSPBS清洗清洗5 5分钟；分钟；1313）预杂交缓冲液孵育）预杂交缓冲液孵育3030分钟；分钟；1414）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；稀释探针； 1515）杂交；）杂交；149第二天第二天1616）将玻片置于）将玻片置于SSCSSC中以去除封片中以去除封片1717）室温，）室温，2 2SSCSSC清洗清洗1010分钟分钟1818）3737，1 1SSCSSC清洗清洗1010分钟分钟1919）3737，0.50.5SSCSSC清洗清洗1010分钟分钟2020）缓冲液）缓冲液A A孵育孵育1010分钟分钟2121）缓冲液）缓冲液A A孵育孵育3030分钟分钟 2222）加入抗地高辛抗体）加入抗地