肿节风药材采收部位与最佳采收期的研究

1、肿节风药材采收部位与最佳采收期的研究                     作者：李成仁 王园园 李小艳 宋晓虹 韦琪生 蒋林 叶创兴【摘要】  目的确定肿节风药材的采收部位与最佳采收期。方法分别将采得的不同季节肿节风药材分为根、茎、叶3部分，以60%乙醇为溶剂回流提取。采用高效液相色谱法测定不同季节肿节风药材各部位中反丁烯二酸和异嗪皮啶的含量；以紫外分光光度法测定其总黄酮的含量。结果

2、肿节风药材叶中总黄酮含量最高，茎中反丁烯二酸含量最高，根中异嗪皮啶含量最高，综合考虑3种有效成分，以6月、8月含量最高。结论6月、8月份为肿节风药材的最佳采收期，以全株采收为宜。 【关键词】  肿节风 药效成分 采收期 采收部位肿节风为金粟兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai的干燥全草，又名九节茶、接骨木等，主要分布于我国华南、华东、西南各省区，在朝鲜、日本、东南亚和印度也有分布。药典2005 年版（部）中记载其具有清热凉血、活血消斑、祛风通络的功效，可用于血热紫斑、紫癜、风湿痹痛、跌打损伤等症1。药实验表明，肿节风具有抗菌消炎、抗肿瘤等作用，

3、已制成各种剂型用于各种炎症和癌症的辅助治疗。其主要药效成分为反丁烯二酸、异嗪皮啶和黄酮类化合物2。肿节风中反丁烯二酸和异嗪皮啶的含量可采用高效液相色谱法进行测定3，4，黄酮类化合物可通过紫外分光光度法测定5。本实验采取3种药效成分同时考察的方法，对不同生长季节的肿节风以及不同部位药用价值进行评估，为肿节风药材的采收提供依据。1   仪器与试药1.1   仪器 Waters高效液相色谱仪（Waters515泵，Waters 2487紫外检测器），恒奥HT-230A柱温箱（天津恒奥公司），YH3000色谱工作站（广州逸海公司）。TU-1901双光束紫外可见分

4、光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。1.2   试药 反丁烯二酸对照品（批号：1541-200001），异嗪皮啶对照品（批号：110837-200304），芦丁对照品（批号：100080-200）购于中国药品生物制品检定所。乙腈（色谱纯，Merck公司），磷酸（色谱纯，Fluka公司），Mili-Q超纯水，其余试剂均为分析纯。    肿节风药材采于广西东兰县肿节风药材GAP基地，自2007-052007-12每月采全株样，根、茎、叶分开，60下烘干。2   方法与结果2.1  对照品溶液的制备2.1.1 

5、; 总黄酮对照品溶液精确称取芦丁对照品20 mg，置于50 ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.4 mg/ml芦丁对照品溶液5。2.1.2  反丁烯二酸与异嗪皮啶对照品溶液精确称取反丁烯二酸对照品7.5 mg，异嗪皮啶对照品1.8 mg，置25 ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液( 含反丁烯二酸0.3 mg/ml，异嗪皮啶0.072 mg/ml) 。2.2  供试品溶液的制备准确称取干燥，粉碎，过3号筛的肿节风药材根、茎、叶粉末各0.5 g，置250 ml烧瓶中，按130的料液比分别加入60%乙醇回流提取1 h，过滤后重

6、复提取2次，合并滤液，减压浓缩至干，以蒸馏水溶解残物，定容至25 ml，备用。2.3  总黄酮测定波长的选择取芦丁对照品溶液0.5 ml，置10 ml容量瓶中，用30%的乙醇补充至5 ml，加入5%NaNO2溶液0.3 ml，放置5 min，加入10%Al(NO3)3溶液0.3 ml，6 min后加入4%NaOH溶液2.0 ml，此时溶液显红色，混匀后以30%乙醇稀释至刻度，静置10 min后于紫外分光光度计下进行全波长光谱扫描，在500 nm处有最大吸收值，因此以500 nm作为总黄酮的检测波长。2.4  色谱条件色谱柱为Agilent Hypersil ODS C18柱

7、（4.6 mm×250 mm，5 m）；流动相A为0.05%磷酸水溶液；流动相B为乙腈；检测波长210 nm；柱温35。梯度条件08 min流动相B 5%；830 min B5%12%；3045 min B12%19%。经测试，样品峰分离度在1.5以上，反丁烯二酸理论塔板数在5 000以上，异嗪皮啶理论塔板数在10 000以上。2.5  标准曲线的绘制2.5.1  总黄酮标准曲线分别取芦丁对照品溶液0，0.25，0.5，0.75，1.25，1.5 ml于10 ml的容量瓶中，按“2.3”项下方法处理后，于紫外分光光度计下测定吸光值，检测波长500 nm。以标样浓度

8、为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程Y=9.497 5X+0.0413, r=0.999 9，线性范围：0.01 0.06 mg/ml。2.5.2  反丁烯二酸与异嗪皮啶标准曲线精确吸取体积为0.04，0.2，0.4，2，4，6，8 ml的反丁烯二酸与异嗪皮啶混合对照品溶液于25ml的容量瓶中，加水稀释至刻度，定容后以0.45 m微孔滤膜过滤，精确吸取20 l，注入高效液相色谱仪测定。以进样质量为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，分别得反丁烯二酸和异嗪皮啶的回归方程为：Y=6 966 848.636 2X+702 737.286 7，r=0.999 6；Y=14 3

9、91 526.525 4X+221 002.013 3，r=0.999 8；线性范围：反丁烯二酸0.024 4.8 g；异嗪皮啶0.0061.152 g。1         2.6  方法学考察2.6.1  总黄酮方法学考察    精密度实验：取肿节风药材全株样品，按“2.2”项下所述方法制备样品溶液，按“2.3”项下方法处理并测定500 nm处吸光值，连续测量5次，以总黄酮含量，RSD为2.49%，表明该法精密度良好。    重复性实

10、验：取同一批药材全株样品6份, 按“2.2”项下所述方法法制备样品溶液，按“2.4”项下所述方法进行测定，以总黄酮含量计算，RSD =2.53 %，表明方法的重复性良好。    稳定性实验：取同一批药材全株样品，按“2.2”项下所述方法法制备样品溶液，3 h内每隔30 min以“2.3”项下方法进行测定，其结果RSD =1.58 %，表明样品在3 h内稳定。    加样回收率实验：取已知含量的肿节风样品，加入一定量对照品，按“2.2”项下方法制备样品溶液，按“2.3”项下方法处理后测定吸光值，得总黄酮的平均回收率为101.8%, RS

11、D=3.44%。2.6.2  反丁烯二酸与异嗪皮啶方法学考察    精密度实验：取肿节风药材全株样品，按“2.2”项下所述方法制备样品溶液，重复进样5次，记录峰面积比值，反丁烯二酸和异嗪皮啶的RSD值分别为1.43%和2.35%，表明仪器的精密度好。    重复性实验：取同一批肿节风药材样品 6 份，按“2.2”项下所述方法制备样品溶液，分别注入高效液相色谱仪进行分析，反丁烯二酸RSD = 4.64 %；异嗪皮啶RSD = 4.13%，表明方法的重复性较好。    稳定性实验：取肿节风药材样品溶

12、液在0，2，4，8，24，48 h 分别进样分析，反丁烯二酸和异嗪皮啶的RSD分别为1.93%和3.02%，表明样品在48 h内稳定。    加样回收率实验：取已知含量的肿节风药材样品，加入一定量对照品，按“2.2”项下制备样品溶液的方法处理，注入高效液相色谱仪进行分析，测得反丁烯二酸的平均回收率为101.8% , RSD = 3.53 %；异嗪皮啶的平均回收率为99.9%，RSD=3.44%。2.7  样品中有效成分含量的测定2.7.1  总黄酮含量的测定精确吸取0.5 ml样品溶液，按“2.3”项下方法依次进行测定。以吸光值代入回归方程进行

13、计算。 各月份不同部位的总黄酮含量见表1。表1  512月份肿节风药材不同部位总黄酮含量（略）2.7.2  反丁烯二酸与异嗪皮啶含量的测定精确吸取样品溶液20 l注入液相色谱仪，按“2.4”项下色谱条件进行测定（对照品与样品色谱图见图12），以峰面积代入回归方程计算。各月份不同部位的反丁烯二酸与异嗪皮啶含量见表23。图1  混合对照品溶液色谱图（略）图2  肿节风样品溶液色谱图（略）表2  512月份肿节风药材不同部位反丁烯二酸含量（略）表3  512月份肿节风药材不同部位异嗪皮啶含量（略）3  讨论3.1  肿节

14、风药材不同部位的有效成分含量对比表13中分别列出了肿节风不同部位总黄酮、反丁烯二酸和异嗪皮啶的含量。将表中数据进行横向对比可看出，各部位的总黄酮含量叶根茎，反丁烯二酸含量茎叶根，而异嗪皮啶含量根茎叶。上述3种有效成分分别在叶、茎、根中含量最高，因此为达到最佳的药用效果，肿节风的采收应以全草采收为宜，部分采收则容易造成某种成分的缺失。3.2  不同采收期肿节风药材的有效成分含量对比表13中分别列出了肿节风不同部位总黄酮、反丁烯二酸和异嗪皮啶的含量。将表中数据进行纵向对比可看出，肿节风各个部位有效成分的含量在不同的生长季节差异甚大：总黄酮的最高含量出现在8月叶中，反丁烯二酸最高含量出现在

15、10月茎中，异嗪皮啶最高含量则出现在6月根中。各有效成分的含量最高点时间不同，因此在采收时需对此进行分析，选取3种成分含量均较高的时间进行采收。    根据“3.1”项下所述，肿节风药用以全草为宜，若同时考虑总黄酮、反丁烯二酸和异嗪皮啶的含量，以6月、8月份肿节风中含量最高。其他生长季节内的肿节风药材，虽然有某种单一有效成分含量较高的情况，但其他有效成分含量却偏低。因此，肿节风药材的最佳采收期为6月和8月。    本实验以512月份肿节风药材为材料，对不同生长季节的肿节风药材不同部位3种有效成分（总黄酮、反丁烯二酸、异嗪皮啶）含量进行了测定。通过各不同生长期的有效成分含量对比可确定，6月、8月为肿节风药材的最佳采收期，此时肿节风药材的总黄酮、反丁烯二酸以及异嗪皮啶含量都很高；通过根、茎、叶3个部位的有效成分含量对比得出，肿节风根中异嗪皮啶含量最高，茎中反丁烯二酸含量最高，叶中总黄酮含量最高，各有效成分在不同部位的分布均不平衡，因此肿节风的采收应以全株采收为宜，这样可保证采得的药材中含有全部的有效成分，从而达到最佳的药用效果。【】  1 国家药典委员会. 药典，部. S. 北京：化学出版社，2005.