肠缺血再灌注大鼠肺损伤时NOS及肺泡巨噬细胞分泌NO的变化

1、    肠缺血再灌注大鼠肺损伤时NOS及肺泡巨噬细胞分泌NO的变化        摘要本实验通过对大鼠肠缺血再灌注后巨噬细胞活化分泌NO及肺组织内NOS的变化进行观察，显示肠缺血再灌注组肺泡巨噬细胞分泌NO的水平及肺内NOS的水平均显著高于假手术对照组，表明肠缺血再灌注后肺内巨噬细胞的iNOS被激活，大量合成并释放NO，其作用一方面可增强杀菌功能，另一方面导致肺组织损伤。关键词缺血再灌注，一氧化氮，一氧化氮合酶，肺泡巨噬细胞The Change of NOS Activity

2、 in Lung Tissue and no Secreted by Alveolar Phagocyte after the Inchemia-reperfusions in Rats small IntestineZhang Shilin， Yu Keli，Bi ping（Biology department，Tianjin Normal university）（Tianjin Friditional Chinese Medicinal Reserch Institute)AbstractThis study was to evaluate the level of nitric oxid

3、e （NO）of secreted by alveolar macrophage and the activity of nitric oxide synthase （NOS）in lung tissue after the ischemia-reperfusions in rat small intestine.The results showed that，comparing with the control group，the level of NO and activity of NOS were obviously enhanced in mould group.It is sugg

4、ested that，after the ischemia-reperfusions in rats small intestine，the induced nitric oxide synthase（iNOS）were activated in alveolar macrophage，plenty of NO were synthesized and released，which can sause bactericidal power enhance and the lung tissue damages.Key wordsIschemia-reperfusions，Nitric oxid

5、e，Nitric oxide synthase， Alveolar macrophage休克后常会引起多器官衰竭（MOF），其中肺是最早受损的靶器官之一。有研究表明，肠道缺血和再灌注能造成全身自由基损伤、炎症细胞的活化、肠粘膜PLA2过度活化以及肠粘膜屏障衰竭与肠源性感染，因此推断肠道可能是创伤休克后MOF的始动器官1。本实验对大鼠肠缺血再灌注后巨噬细胞活化分泌一氧化氮（NO）及肺组织内一氧化氮合酶（NOS）的变化进行了观察，并对NO在肺损伤过程中的作用进行了探讨。1材料与方法1.1试剂NO和NOS测定试剂盒为北京邦定生物公司产品；MRPI-1640培基（简称1640）为Gibco公司产品，胎

6、牛血清（NCS）为中国科学院血液病研究所产品。1.2实验动物与分组健康Wistar大鼠（购于军事医学科学院实验动物中心）52只，体重250g270g，雌雄各半，随机分成对照组（24例）和模型组（28例）。1.3动物处理方法模型组大鼠动物在禁食不禁水12 h后，用1戊巴比妥盐经腹腔注射麻醉（3mlkg1），无菌条件下进入腹腔。用动脉夹夹闭肠系膜上动脉根部45 min后松夹，缝合腹壁，于再灌注后6 h取材。假手术对照组大鼠只钝性分离肠系膜上动脉根部周围组织，不做其它处理。1.4大鼠肺巨噬细胞的分离与培养4的水合氯醛（7.5 mgkg-1）经腹腔注射麻醉，于胸骨柄上缘用套管针穿刺至支气管分叉水平。用

7、生理盐水4 ml，注入肺脏后，轻轻按摩胸部，回抽冲洗液，如此反复冲洗4次。冲洗液每分钟1700 转离心10 min，弃掉上清液，用Hanks液反复洗涤3次。甲紫和瑞氏染色证实为巨噬细胞，纯度90，台盼蓝染色鉴定细胞活率为95。将上述细胞悬液离心弃上清，将沉淀的细胞用适量的1640培基混匀后置37、5CO2孵箱内12 h，弃掉非贴壁细胞即可获得高纯度的大鼠肺巨噬细胞。调细胞至1×106/ml，分别加入24孔板内，置37，5CO2孵箱内培养48 h，收集培养上清液，存放于20待测。1.5观察指标1.5.1一氧化氮（NO）测定：取细胞培养上清液，应用Griess法2参照试剂盒说明书进行NO

8、2测定，以NO2代表NO的变化，结果以M表示。1.5.2肺组织内一氧化氮合酶（NOS）活性测定：取各组动物肺组织，加入40 mM，pH7.2的磷酸钾缓冲液10（WV），匀浆器匀浆，每分钟10000转离心20min，取上清。应用分光光度法3参照试剂盒说明书进行测定，结果以每克组织每分钟产生NO的量来表示，即molmin1每克组织。1.5.3左心室抽抗凝血，测PaO2和PaCO2。1.5.4断头放血，取肺称重，计算肺系数（肺重量/体重×100）。1.6统计学处理用计算机SPSS统计学软件包对所得结果进行方差分析。2结果2.1模型组肺泡巨噬细胞分泌NO的水平（3.60±0.15）

9、显著高于假手术对照组（P0.001），模型组肺内NOS的水平（2.01±0.13）显著高于假手术对照组（P0.05），（见表1）。表1各组动物肺内NOS及肺泡巨噬细胞分泌NO的变化情况（±S）组别NOS（molming）NO2（M）PaO2PaCO2肺系数对照组0.32±0.071.15±0.1112.19±0.294.02±0.150.65±0.07造模组2.01±0.13b3.60±0.15a9.10±0.35b4.64±0.22b0.97±0.10bVS 对照组a-P0

10、.001b-P0.05 2.2模型组动脉血PaO2值明显低于对照组，而PaCO2值均高于对照组。模型组肺系数0.97±0.10，高于对照组的0.65±0.07（P0.05）。（见表1）。3讨论NO是一氧化氮合酶（NOS）在NHDPH、FAD和四氢化物蝶呤等辅助因子的作用下，以精氨酸（L-Arg）为底物，使其N端胍基脱氨氧化，生成的氮氧化物，是一种简单的自由基性的气体，溶于水（20及1个大气压下，高达2 mmolL-1）和脂质中，故可自由地弥散于细胞外，发挥其活性作用，而不存留于其形成部位4，5。NO的生理效应众多，包括调节血管张力和血压，抑制血小板和白细胞聚集粘附的作用，抑

11、制血管平滑肌细胞增殖，神经细胞间的信息传递，调节细胞粘附分子的表达以及参与机体防御机能6，7。近年的研究揭示巨噬细胞对多种病源体和肿瘤细胞的杀伤是通过NO完成的。巨噬细胞中含有诱导型一氧化氮合酶（iNOS），激活（IFN-，TNF-等）后可合成大量NO。近年研究已证实NO具有明显毒性作用8，9，其机制包括：（1）NO作用于Fe蛋白，影响细胞呼吸及能量代谢；使ADP核糖化；抑制DNA合成。（2）NO与的反应生成ONOO和OH。其中OH作为氧自由基中一种极强的细胞毒，是机体细胞损伤的重要途径；ONOO是一种强氧化剂，可迅速细胞膜脂质过氧化，并抑制上皮细胞离了通道，这与急性感染时肺内液体及其平衡紊乱

12、有关。肺泡巨噬细胞为经管壁溢出之游离单核细胞定植于肺泡腔内所形成，生理状况下承担免疫监视、抗原呈递及吞噬入侵的病原微生物和灰尘等作用。肠缺血再灌注后可引起肠道细菌内毒素的移位，已经证实血中内毒素水平异常升高，使巨噬细胞活化并释放多种致损介质，介导组织损伤过程的发生10。我们发现，肠缺血再灌注组大鼠肺泡巨噬分泌NO的水平显著高于假手术对照组，同时肠缺血再灌注组大鼠肺内NOS明显高于假手术对照组。可见，此时定居于肺内的巨噬细胞内的iNOS被IFN-、TNF-及LPS等激活，大量合成并释放NO，一方面可增强杀菌功能，另一方面导致肺组织损伤。张世林（天津中医研究所300193）宇克莉（天津师范大学生物

13、系300193）毕平（天津师范大学生物系300193）参考文献1胡森：创伤后多系统器官衰竭（MSOF）动物模型的实验研究中华整形烧伤外科杂志1992；8（1）：22Ding AH，et al：Release of reactive nitrogen intermediates and reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal macrophages.J Immunol1988；141：24073Knowles RG，et al：Anti-inflammatory glucocorticoids inhibit the inducti

14、on by endotoxin of nitric oxide synthaso in the lung liver and aorta of the rat.Biochem Biophys Res Commun 1990；172（3）：10424Barnes PJ，et al：Nitric oxide and lung disease.Thorax 1993；48：1034.5Moncada S：The L-arginine-nitric oxide pathway.The New Engl J Med 1993；329：20026Anggard E.：Nitric oxide：mediator，murdereer，and medicine.Lancet 1994；343：11997Gaston B，et al：The bilogy of nitrogen oxides in the airways.Am J Respir crit care Med 1994；149：5388Freeman B.Free radical chemistry of nitric oxide.Chest 1994；1