聚合酶链反应在幽门螺杆菌感染中的新进展

1、聚合酶链反应在幽门螺杆菌感染中的新进展    关键词： 聚合酶链反应 幽门螺杆菌感染 发现幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）至今已有十多年，在这十多年期间对Hp的研究进展飞速，已从细胞水平逐渐深入到分子水平。现在认为Hp是胃炎，消化性溃疡的主要致病因素，而且与胃癌有密切关系。Hp本身的螺形，鞭毛结构及其分泌的细菌毒素，空泡毒素，尿素酶，粘蛋白酶，过氧化氢酶，磷脂酶，热休克蛋白，低分子趋化性蛋白质粘附素等都与其致病相关。诊断Hp感染已从传统的细菌学，免疫学手段发展到分子生物学方法，尤其是通过分析Hp核酸，已清楚Hp的部分核苷酸序列，

2、这为聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）用于Hp研究创造了条件。本文就近年有关PCR在Hp研究中的应用作一综述。1PCR原理PCR是近年发展起来的一种体外扩增特DNA片段的技术，有关它的原理许多文献已有详细介绍，这里只作简述PCR的每次扩增循环包括三步，第1步为变性，在高温下把双链靶DNA拆开；第2步，在较低的温度下使引物与靶DNA互补；第3步在中间温度下，在DNA多聚酶作用下，引物按模板DNA延长，典型的PCR包括3050循环，如此重复循环，使被扩增的靶核苷酸以几何级数扩增，在PCR操作中，有几点必须考虑。选择引物长度以1530个碱基为宜，太短特异性不佳

3、，太长不增加特异性而合成费用增加。引物中应尽量避免单高重复的核苷酸结构，同时还要考虑引物本身的物理特性，避免经物自身退火。反应的退火温度慎重选择，温度高可提高特异性，但敏感性隆低，温度低则反之。2引物选择2.1尿素酶基因核苷酸Hp分泌大量的尿素酶，该酶是导致哺乳动物对Hp产生免疫应答的重要抗原，可能是Hp的重要致病因子之一，因此许多学者采用尿素酶核苷酸序列中的部分片段作为引物。Clayton等报告了Hp尿素酶基因（ureA和tureB）的核苷酸序列，筛选到ureA和tureB两个亚单位，并测得了它们的核苷酸序列。目前有代表性的采用以尿素酶部分核苷酸顺序为引物对的有：Clayton采用一对18个

4、碱基的寡核苷酸链为引物，特异引导扩增后的DNA产物为411个碱基对。其他学者都是以Clayton报告的Hp尿素酶基因的部分核苷酸序列为依据而设计PCR的引物。Courcoux等选择尿一纱酶C基因中的一段294bp作PCR反应。2.216S rRNA核苷酸顺序所有细菌的rRNAs根据其大小分为三种：含120个核苷酸的5s rRNA；含1600个核苷酸的16S rRNA及含3000个核苷酸的23S rRNA。分析细菌16s rRNA现已作为细菌分类的一个指标。大量研究证明，Hp的部分16s rRNA与弯曲菌属细菌显著不同，目前采用以16S rRNA部分核苷酸顺序为引物的主要有Ho等，采用一对20个

5、碱基的寡核苷酸链为引物，特异引导扩增后的DNA产物为109个碱基对。有些学者用PCR拉增Hp及与其相类似微生物的16s rRNA，以此来识别H.pylori，H.mustelac和 H.canis。2.3编码Hp特6kD蛋白质的核苷酸O'Toole等报告Hp提取物中大量的26000蛋白质，作者提出此蛋白质是Hp特异蛋白质，并分析编码该蛋白质核苷酸序列。Hammar等以此为依据，设计一对23个碱基的寡核苷酸链为引物，特异引导拉增后的DNA产物为298个碱基对。2.4其它Valentine等从基因库中选出1.9kd的DNA片段作为探针，与19株Hp反应都为阳性，与32种306株其它细菌均无

6、反应，其特异性为98.7，假阳性是由于载体污染。由此作者从1.9kdDNA中的已知288个碱基片段中选出一对20个寡核苷酸链为引物，其特异引导扩增后DNA产物为203个碱基对。纵观不同学者选出的引物，这些引物都能特异地以Hp的DNA为模板，扩增Hp的部分核苷酸，而不引导扩增其它细菌的核苷酸。3应用3.1临床诊断自从成功分离出Hp以来，由于Hp感染在临床上的重要性，迫切需要一个快速敏感检测检测标本的方法，学者们在不断探索各种诊断Hp感染的方法。传统的培养方法由于细菌生长要求高，死亡或菌量过少，则常规方法难以检出，其它方法如同位素标记的二氧化碳呼气试验，费用贵，快速尿素酶试验由于制剂标准不统一，消

7、化道其它一些细菌也产生尿素酶，使该方法的特异性受到影响，检测抗Hp抗体方法简易，但很难区分是否为近期感染，随着分子生物学技术不断发展，最近有些实验室采用PCR技术诊断Hp感染，取得满意结果，Ho等采用16s rRNA的部分核苷酸序列为引物，其引物不引导拉增与Hp的16S rRNA十分相近的H.cinaedi，H.mustelac，H.hepaticus和产生琥珀酸沃林氏菌。检测10份已知Hp阳性的病理切片都为阳性，另外4份胃粘膜活检标本符合已知结果并且能检测到不能培养的Hp圆球体的DNA，进一步测试从猪，狒狒和猴胃中分离的细菌，并用内部探针与扩增的DNA产物杂交，提示从这些动物中分离的细菌都为

8、Hp。Engstrand等选用的16s rRNA引物顺序与Ho者不同，作者采用了反向转录PCR技术，先利用反转录酶合成RNA，然后再扩增cDNA。其敏感性比常规PCR提高2550倍，可检测到2个细菌，检测15份标本，14份标本与呼气试验和培养相同，该方法的特异性为100，Nguycn等用该方示检测口腔齿斑标本，18例Hp阳性病人中有7例阳性，7例未感染Hp病人中，口齿斑未测到Hp，该结果提示口腔很可能是Hp除胃以外体内另一居留地，这也可能是有些病人抗Hp治疗后复发的原因之一。Clayton等采用urcA基因的部分核苷酸序列为引物，与50株已知Hp反应全部为阳性，与产琥珀酸沃林氏菌，空肠弯曲菌，

9、结肠弯曲菌及螺旋菌属（Helicobacter）中另一产尿素酶的细菌H.mustelae反应都为阴性。作者除了直接检测胃粘膜外还检测了石蜡包埋病理切片，效果较理想。台湾学者设计了重叠PCR。作者选用了两对以尿素酶基因的部分核苷酸序列为引物，当第一对引物的PCR循环结束时，将其拉扩增后的DNA产物再进行第2对引物的PCR循环，其敏感可提高100倍，而无假阳性。作者分析了两例扩增后DNA产物的部分核苷酸序列，在183个碱基对中与已报道的尿素酶基因序列有98的同源性。Hammar等采用了编码Hp特异蛋白质的部分核苷酸序列为引物，27例胃粘膜标本中，19例PCR阳性，而在所有PCR阳性标本中只有15例培养阳性，另外唾液杯本有9例阳性。Valcntinc等还检测了胃液标本，在13例胃粘膜活检阳性标本中，有11例胃液标本阳性，而采集胃液比采集胃粘膜方便，只需鼻胃管即操作，对那些不易做胃镜的病人和儿童可能是一个