重组人干扰素大肠杆菌高效表达系统的建立

1、天津医药年月第卷第期重组人干扰素大肠杆菌高效表达系统的建立刘新宇摘要梁东春左爱军郭刚张镜宇目的：构建重组人干扰素方（）原核表达系统，以获得在大肠杆菌中的高效表达。法：依据大肠杆菌遗传密码子频率表，在不改变氨基酸组成的情况下，人工半合成适于在大肠杆菌中表达的编码序列；经扩增后，克隆人表达型质粒载体；筛选阳性菌落，温度诱导表达，表达产物行聚丙烯酰胺凝蛋白质印迹（）鉴定，并以人羊膜细胞水泡性口炎病毒（）系统鉴定胶电泳（）、抗病毒活性。结果：产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定可见与预期大小符合的的条带；重组质粒经序列分析，证实含有与预期相符且读码框架正确的编码序列；可见与分子质量大小一致的蛋白质条带，鉴定此条带

2、为，其比活性达（）×。结论：在大肠杆菌中的高效表达系统构建成功，且能高水平地表达出具有生物活性的。关键词干扰素大肠杆菌基因表达原核表达系统遗传密码，：（）：，：，（）×：干扰素（）是由机体的白细胞分泌的一种糖蛋白，具有较强的广谱抗病毒、抗肿瘤的作用并参与免疫调节作用。其中，在临床上被用来治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎、流行性腮腺炎、病毒性心肌炎及恶性肿瘤。目前获取的主要途经是用基因工程获得重组人干扰素（），但表达量还不甚理想。大肠杆菌是基因工程中常用的工程菌，但由于其在密码子的使用频率上与哺乳动物细胞有很大不同，因此一些真核基因难以在大肠杆菌中高效表达。人工改造基因则可通过对大

3、肠杆菌的稀有密码子进行优化而获得在大肠杆菌中的高表达。本研究拟构建重组人干扰素大肠杆菌高效表达系统，旨在获得大量重组人干扰素。材料与方法，质粒（含有启动材料大肠杆菌菌株子），人羊膜细胞系（细胞系）和水泡性口炎病毒（）为本室保存。各种限制性内切酶及购自公司，山羊抗人多克隆一抗及标准品购自公司，辣根过氧化物酶标兔抗山羊二抗、膜及其余常用分子生物学试剂购自鼎国公司。方法将序列中的稀引物及模板的设计有密码子替换为大肠杆菌偏嗜性密码子，然后将该序列分为端开始分别标记为，每段为段，自组，每组的个片段间有个碱基互补，共组。引物共作者单位：天津医科大学生化教研室（刘新宇）；天津市内分泌研究所（梁东春，左爱军，

4、郭刚，张镜宇）合成条，分别标记为，。在的端引入限制性内切酶的酶切位点和起始密码子，的端引入了限制性内切酶的酶切位点和终止密码子，适量中。输出能量下，冰浴中进行超声碎菌。×离心，以适量悬浮沉淀，取少量用于电泳鉴定。电泳结果经凝胶成像系统扫描后，经软件分析表达蛋白的含量。（）包涵体的处理及蛋白质印迹（）：鉴定以尿素洗涤沉淀后溶解包涵体于尿素中，以谷胱甘肽进行复性。取少量复性液行及鉴定。行后，半干法将蛋白条带电转印至膜上，以山羊抗。引物，含有与相邻片段分别匹配的序列。基因扩增多步法完成全编码见图。以和为模板，序列的分段扩增和拼接为引物，体系构成（反应体系）：（），（），（），（），（），&

5、#215;，体积补至。反应条件：，个循环；最终延伸。产物行琼脂糖凝胶电泳，回收产物标记为待用。以同样的方法分别以，为模板，为引物及，多克隆抗体作一抗，以标记的兔抗山羊作二抗进行印迹，观察结果并照相。（）生物活性分析：在将细胞培养成单系统上按细胞病变抑制法测定。层后，加不同浓度的干扰素处理，对照组用营养液代替，培养后弃去干扰素，加病毒攻击培养细胞，培养至对照细胞完全病变后观察结果。采用结晶紫染色，酶标仪测定，并以标准品校正活性。为模板，为引物扩增并回收产物，相应标记为，。再以，为模板，为引物进行（加样量及反应条件同上），回收产物标记为（）待用。以（），结果为模板，为引物，作体系（加样量及反应条件

6、同上），产物行琼脂糖凝胶电泳。偏嗜性基因的扩增结果产物中有与预期大小相符合的左右的条带产生，见图。：产物；：图分段扩增和拼接基因编码序列示意图图产物的琼脂糖凝胶电泳表达质粒的构建大量扩增大肠杆重组质粒的酶切鉴定电泳结果见图，质粒菌偏嗜性基因，以北京鼎国生物技术公司纯化试剂盒对琼脂糖凝胶电泳的产物进行回收，回收的产物用限制性内切酶和进行双酶切。回收酶切产物，与相同酶切处理的原核表达质粒载体，酶切进行连接。连接产物转化感受态大肠杆菌鉴定，筛选出阳性克隆，命名为，并进行序列分析。经酶切后形成大小条条带，一条为质粒载体本身，另一条大小约为，与所插入的目的基因大小相符合，证明该质粒为重组质粒（）。序列分

7、析证实插入序列与序列相符。测序结果见图，与预期相符。的肽链内含有个半胱氨酸残基可最终形挑取含重组质粒的大温度诱导表达肠杆菌单菌落至含抗生素的液体培养基中，成个分子内二硫键及。震荡培养，转移培养液至培养基中继续培养至，将培养温度升高至，培养。表达产物的见图，可见重组质粒诱导，表达产物的碎菌后沉淀中含有与预期分子质量大小相符的蛋白。表达产物的鉴定（）聚丙烯酰胺凝胶电泳（）：离心收集菌体，以清洗沉淀次，将沉淀重悬于电泳后染色经扫描分析结果见图，可见各天津医药年月第卷第期扫描后吸光度值蛋白条带在凝胶上位置（）图表达产物行后染色并扫描分析结果：；：图重组质粒的酶切鉴定鉴定结果见图，经显色后在预期位置可见

8、深色条带，位置与氨基黑染色后的深染条带相对应。图的氨基酸构成及其编码序列的碱基组成：包涵体处理产物经分离后氨基黑染色；：蛋白质分子质量标志，经氨基黑染色；：包涵体处理产物经分离后显色图鉴定结果生物活性测定结果包涵体经处理后，获得一定纯度的，纯度超过，比活性达（）×。讨论根据密码子的简并性，多种不同的密码子可编码同一种氨基酸。但不同的生物在密码子的使用频：重组质粒诱导，表达产物的碎菌后上清液；：蛋白质分子质量标志，；率上常表现出一定的偏嗜性，这种密码子偏嗜性是由生物的物种特征决定的。由于基因工程的原因，重组基因在原核系统中高效表达的影响因素正日益受到关注，这其中探讨较多的主要是密码子的

9、偏嗜性。目前探讨较多的大肠杆菌稀有密码子有：重组质粒诱导，表达产物的碎菌后沉淀图重组质粒诱导表达产物的蛋白条带扫描峰型，箭头所指为目的蛋白条带。经计算表达的目的蛋白占菌体总蛋白的。和，它们均编码精氨酸。在人类基因中常见的、属于大肠杆菌的稀有密码子，在大肠杆菌中出现的频率仅为和。特别是当这个密码子串联连续出现时，与天然的，的蛋白中残留的问题，这些都为的生产即下游工程奠定了基础。总之，本研究通过构建重组人干扰素大肠杆菌高效表达系统，获得了有生物活性的的高效表达，同时也建立了一条在原核生物中表达真核基因的技术路线。参考文献，：，：，：，：，（）：纯化及抗的高效表达、李武平，吕宏亮，段招军，等干扰素病

10、毒活性研究病毒学报，（）：（）序列（）近似，竞争与结合，会造成外源基因表达错误或提前终止。的开放读码框中就含有个、个，其中就含有和这样连续出现的稀有密码子。笔者根据人和大肠杆菌密码子使用频率的不同，根据密码子的简并性，在不改变的一级结构的情况下，在人工合成，对的基因时，通过密码子优化的方法在大肠杆菌中使用频率极低的密码子进行了替换，将全部替换成，对其他使用频率较低的密码子也进行了替换，以利于在大肠杆菌中的高效表达。利用化学法直接合成单链合成过程中，发生错误的几率随着单链的延长而增加，且直接合成法合成较长片段的费用极其昂贵。由于干扰素刘丽华，哈斯阿古拉，李宏，等按大肠杆菌高表达序列设计的人干扰素

11、基因的化学合成和克隆内蒙古大学学报（自然科学版），（）：的序列相对较长，不宜通过化学合成法直接合成。因此，本实验采取了分段扩增，再通过拼接的方法：即先合成条单链，扩增出条较长的，再通过引物所引入的互补区拼接完整的编码序列。本实验是以含启动子的质粒作为高效表达的载体，在大肠杆菌中进行表达。启动子的启动为受温度调节的强启动子，且无需异丙基硫代半乳糖苷（）诱导，避免了获得的目，：，：（收稿修回）国外医学动态高血压患者左室向心性几何形状对心血管预后有不良影响左室（）质量和几何形状预示高血压时发生心血管事件的危险性。肥厚（）恢复可能含有重要预后意义。在抗高血压治疗时，几何形状改变与预后的关系尚未确定。等对例经过基线和随访超声心动图距最后一次检查（±）个月而预期无并发症的高血压患者再随访（±）个月。患者由家庭医生给予抗高血压治疗。结果：有例患者在最后的随访超声心动图检查之后发生第一次心血管事件。从基线到随访期间持续存在的，肯定是心血管事件的独立性预告。在超声心动图随访中有（）或无（）患者中，向心性几何形状的肥厚者（相对性室壁厚度）的心血管发