荧光定量技术及miRNA定量

1、荧光定量 PCR 技术及其在 microRNA 定量分 析方面应用摘要荧光定量 PCR 技术是近几年在 PCR 技术基础上发展起来的一种核酸定 性定量技术。荧光定量 PCR 具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准 确、速度快、全封闭反应等特点 , 扩大了 PCR 的应用范围,成为分子生物 学和医学研究中的重要工具。 microRNA 是存在于真核生物中的一种大小为 20-25nt 的非编码 RNA 。自 2001年被发现以来,一直备受关注。论文综述 了荧 光定 量 PCR 技 术的原 理 、 荧光定 量 PCR 实时 定量检测系 统及其 在 microRNA 表达分析方面的应用。关键词:荧光

2、定量 PCR 荧光染料 探针标记 microRNA定量1前言荧光定量 PCR 是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对 PCR 产 物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进 行分析, 计算待测样品模板的初始浓度。 该技术是由美国 PE (Perkin Elmer 公司 1995年研制出来的一种新的核酸定量技术,目前已经得到广泛应用。 它不仅实现了 PCR 技术从定性到定量的飞跃, 更重要的是与常规 PCR 相比, 它具有操作简便、快速高效、高通量、特异性强、灵敏度更高、重复性好、 定量准确、自动化程度高、全封闭式反应等优点成为分子生物学和医学研 究中的重要工具 1。m

3、icroRNA( miRNA是一类广泛存在于真核生物中 , 不编码蛋白质的短 序列 RNA, 长度为 20-24nt 。成熟 miRNA 的 5端为磷酸基团 , 3端为羟基 , 它通过与靶 mRNA 3端非编码区特异性结合 , 引起靶 mRNA 的降解或者抑制其 翻译 , 从而调低基因表达。 miRNAs 在控制真核生物生长发育、新陈代谢和 生理反应等方面起着重要作用。 除此之外 , 多数 miRNA 还具有高度保守性、时序性和组织特异性 2-6。目前大量 miRNA 在真核生物中被发现 , 但绝大多 数 miRNA 的生物学功能研究尚显滞后 , 而 miRNA 生物学功能研究的重要一 环是探

4、究 miRNA 在特定时期、特定组织及特定环境的表达特性 , 进而实现 miRNA 对目标基因的调控。利用荧光定量 PCR 技术,了解 miRNA 在不同组织 部位的时空表达是研究其功能的重要环节。2荧光定量 PCR 原理荧光定量 PCR 最早称 TaqMan PCR,后来也叫 Real-Time PCR,该技术 是在常规 PCR 基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功 能的。其基本原理是在 PCR 体系中加入荧光基团,随着 PCR 反应的进行, PCR 反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加,利用荧光信号累积实 时监测整个 PCR 进程,最后通过标准曲线或其他方法对未知模板

5、进行相对 或绝对定量分析的方法 7。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样 我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增 曲线图。 一般而言, 荧光扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段,扩增的荧光信号 被荧光背景信号所掩盖,无法判断产物量的变化。在荧光信号指数扩增阶 段, PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,我们可以选择 在这个阶段进行定量分析。 而在平台期, 扩增产物已不再呈指数级的增加, 这是由于随着 PCR 循环数的增加, DNA 聚合酶的失活, dNTP 和引物的枯竭 以及反应副产物的干扰等

6、原因造成的。此阶段 PCR 扩增产物的数量与原始 模板数量之间没有一个固定的比例关系,通过检测扩增产物很难对原始模 板进行准确定量 8。为了便于对所检测样本进行比较, 在实时荧光定量 PCR 反应的指数期, 首先需设定一定荧光信号的域值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任 意位置上,但一般这个域值(threshold 是以 PCR 反应的前 15个循环的 荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是 3-15个循环的荧光信 号的标准偏差的 10倍。另外阈值与扩增出线的交点为 Ct 值, C 代表 Cycle (循环 , t 代表 threshold(阈值 。 Ct 值是指每个反应管内的荧光信

7、号达到阈值时所经历的循环数(threshold cycle 9。研究表明,每个模板 的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多, Ct 值越小 10,11。 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线, 其中横坐标代 表起始拷贝数的对数,纵坐标代表 Ct 值如下图所示。因此,只要获得未知 样品的 Ct 值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 3荧光定量 PCR 技术中标记方法的分类荧光定量检测可分为扩增序列非特异和扩增序列特异两类检测。根据 所使用的标记物不同又可分为荧光染料法和荧光探针法两种。荧光染料法 包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料,非饱和荧光染料的典型代表

8、就是现 在最常用的 SYBR Green,饱和荧光染料有 Eva Green、 LC Green等;荧 光探针法包括水解探针法、 Beacon 技术(分子信标技术 、杂交探针以及 Scorpion 引物 /探针等。3.1非特异性的 DNA 结合染料法荧光染料能结合在 DNA 双链结构的小沟中而发光,而游离的荧光染料 不发出荧光,因此扩增开始时检测不到荧光信号随着扩增的进行,荧光染 料与逐渐增多的 dsDNA 结合,荧光强度逐渐增强,直到达到阈值,被荧光 探测系统检测到 12。 染料与 DNA 双链分子的结合是非特异性的 , 它可以和反 应体系中所有 DNA 分子结合 , 易受到非特异性扩增和引

9、物二聚体的影响 , 使定量结果不可靠。因此引物设计和反应条件的优化对消除非特异性荧光 有很大帮助。在实验中常用的荧光染料有 Pico Green 和 SYBR Green。 SYBR Green染料的应用最为广泛,能与所有的双链 DNA 结合,它的最大 吸收波长约为 497 nm,发射波长最大约为 520 nm,适合于所有的荧光定量 PCR 。如图 3为 SYBR Green的工作原理。然而,正由于能和所有双链 DNA 结合,使得引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起假阳性而 影响定量的精确性。 Pico Green 是一种新型的染料,与 SYBR Green相 比,其灵敏度较高,可以

10、检测出至少 25pg mL -1的 dsDNA 分子,且具有线性 范围广, RNA ssDNA 及其他物质的影响小的优点 13。荧光染料的优势在于 它能监测任何 dsDNA 序列的扩增,不需要设计探针且方便、成本低。但由 于染料与 DNA 双链分子的结合是非特异性的,一首非特异性扩增和引物二 聚体的影响,使得定量结果不可靠。可以借助溶解曲线分析法区分非特异 性产物和引物二聚体所产生的荧光,排除假阳性。 3.2特异性荧光定量 PCR特异性荧光定量 PCR 的基本原理是当一个荧光分子(又称供体分子 的荧光光谱与另一个荧光分子(又称受体分子的激发光谱相重叠时,供 体荧光分子的激发能诱导受体分子发出荧

11、光,同时供体荧光分子自身的荧 光强度衰减,这种现象即是荧光 FRET 。当 PCR反应开始后,荧光探针的发 光基团所发出的荧光强度与 PCR 产物的数量呈对应关系,因此对荧光信号 进行检测即可实现对 PCR 产物的准确定量 14。3.2.1水解探针(TaqMan 探针法TaqMan 探针是应用最广泛的水解探针,它是一种寡核苷酸探针, 5 端和 3端分别标记一个报告荧光基团和一个淬火荧光基团。 其基本原理主 要是在 PCR 反应体系中加入一个特异的荧光标记探针,当探针完整时,检 测不到荧光信号。在 PCR 退火时,探针与模板发生特异性杂交,然后引物 沿模板 DNA 延伸到达探针,而 Taq 酶有

12、 5 -3外切活性,发生置换反应使 得 3端与 5端分离,荧光信号释放,荧光检测系统就能检测到光密度随 PCR 反应进行而增加。模板每复制一次,就有一个荧光信号被释放。因此, 根据 PCR 反应液中得荧光强度即可计算出初始模板的数量 15。 图 4是TaqMan 图 3 SYBR GREEN 1工作原理探针的工作原理。 图 4TaqMan 探针工作原理3.2.2分子信标分子信标(也称为分子灯塔 ,是一茎环发卡结构的单链 DNA 分子,环 部与靶 DNA 序列互补,长度约 15-35bp ,茎部 GC 含量高,且与靶 DNA 序列 无同源性,约 8bp 。探针的 3端和 5端分别标记有荧光报告基

13、团和荧光 淬火基团。探针自身两端序列互补,形成发卡结构,不发荧光。当探针特 异的模板杂交时,破坏探针发卡结构,产生荧光。随着 PCR 产物的积累, 荧光信号不断增强,课被荧光检测仪检测到。如图 5所示,为分子信标的 工作原理。理论上,分子信标是可以区分单个核苷酸差异的 DNA ,但探针标 记比较复杂,并且在溶液中,探针如果不能无选择性折叠则会造成部分荧 光本底信号。另外,如果茎结构的热力学温度过高时,会影响探针与靶序 列杂交。总体来说,分子信标的优点是特异性强,荧光背景低;缺点是设 计困难,杂交探针不能完全与模板结合,稳定性较差,价格高 16。 3.2.3杂交探针杂交探针又称双杂交探针,由 A

14、 、 B 两条相邻探针组成,探针 A 在 3 端携带一荧光供体,另一探针 B 的 5端携带一荧光受体,探针 B 的 3端 被封闭,防止在退火时延伸 17。在 PCR 退火阶段,两个探针杂交在模板 DNA 的相邻区段,并头尾结合,两者产生 FRET 现象,发出荧光,当两探针游离 时,无荧光产生。反应中使用了两个探针,只有两探针独立杂交在正确的 靶序列上才能检测到荧光信号,增加了反应的特异性,对探针设计提供了 更多选择。但两个探针结合于模板上影响扩增效率 , 合成两个探针 , 成本相 对较高 18。由于 FRET 探针是靠近发光,所以荧光检测仪检测到的信号是实 时信号,而不是累积信号 11。3.2

15、.4蝎子引物法蝎子引物 /探针即 Scorpion 引物 /探针。该方法将序列特异引物延伸和 探针杂交转换成单分子活动,直到聚合酶水解双标记才发生荧光信号,与 较慢的 TaqMan 反应相比,使信号反应速度增快 19。 Scorpion 引物 /探针是 由一条发卡结构的探针和一条引物构成,探针的 5端和 3端分别连有报 告荧光和淬火荧光。在 PCR的变性阶段,探针的发卡结构会打开,退火的 图 5 分子信标工作原理时候与模板 DNA 结合,报告荧光和淬火荧光分离而产生荧光。 Scorpion 引 物 /探针中,序列特异性引物和探针在同一个分子上,因此,更加灵敏,荧 光信号产生的特别快。图 6是蝎

16、子引物法的工作原理图。 4荧光定量 PCR 技术的定量方法在荧光定量 PCR 中,模板定量有绝对定量和相对定量两种。该技术可 以对 DNA 、 RNA 样品进行定性和定量分析。绝对定量可以得到某一个样本中 基因的拷贝数和浓度;相对定量可以比较不同方式处理的两个样本中得基 因表达水平。4.1标准曲线的绝对定量法用已知浓度的标准品作为模板进行 PCR 扩增,以标准品的浓度的对数 值为横坐标,以所测得的 Ct 值为纵坐标,绘制出标准曲线。然后在相同条 件下检测未知样品的 Ct 值,根据标准曲线可计算出未知样品的拷贝数。定 量的标准曲线可以通过化学合成目的基因,或者将已知基因 DNA片段克隆 图 6

17、蝎子探针法的工作原理在载体上,提取质粒后,测量浓度并计算出其拷贝数,然后再进行 5倍或 10倍系列稀释作为 PCR 的模板,制作标准曲线。根据产生曲线的斜率可以 计算出 PCR 效率。如果 PCR 效率大于 100%,说明加入的已知阳性对照不正 确,或者在标准品中有 PCR 抑制物。如果有进行 PCR 效率计算,则可能导 致高估未知样品的模板量。4.2双标准曲线法的相对定量法双标准曲线法是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因并 用目的基因和管家基因的标准品分别作出标准曲线处理与未处 理样品同时 扩增目的基因和管家基因获得 Ct 值然后从各自的标准曲线上求出初始模板 量经管家基因均一化处

18、理后求出目的基因的相对含量 20。使用相对定量时, 要求所有样品扩增的 PCR 效率相近,一般要求大于 90%。定量 PCR 过程中, 要求管家基因的表达量不受实验处理的影响,而且其表达量在不同组织中 也不发生变化。而目前还没有一种适用于各种材料的通用管家基因,因此 在实验过程中应尽量选择一种表达量变化较小的管家基因。通常选用的管 家基因有 GAPDH 、 -actin 2、 2微球蛋白、 18SrRNA 、 TATA-box 等。 5荧光定量 PCR 在 microRNA 定量方面的应用成熟 miRNA 长度为 20-24nt ,与常规 PCR 反应中的引物长度相近,因此 常规 PCR 无法

19、实现对 miRNA 的检测,这是 miRNA 分析检测研究中的一大挑 战 21。如今,科学家已经研究出多种 miRNA 的定量检测技术,有基于直接 杂 交 的 检 测 技 术 , 如 Northern blotting 22,23, mirVana miRNA detection(Ambion公司 和 microarray 24,25等 , 这些方法的优点是通量高 , 一次可以同时检测多个 miRNA 的表达情况 , 缺点是技术含量较高 , 成本大 , 还存在同一 miRNA 不同家族成员之间互相错配杂交的噪音信号 , 且不适合 表 达 量 较 低 的 miRNA 检 测 ; 结 合 PCR

20、与 探 针 的 定 量 检 测 技 术 , 如 stem-loop 26, key-like27及 Ligation Assay28, 这三者需要使用 miRNA 特异的探针 , 这类方法的突出优点是特异性强 , 常常能区分同一 miRNA 家 族的不同变体 , 缺点是探针的设计与合成需借助于商业公司 , 方便性与特异性很难得到统一的解决 ; 基于 PCR 与荧光染料如 SYBR Green的定量检测 技术 , 如 poly(A聚合酶加尾法 29、引物延伸法 30、 Multiplexed RT法 31和 miR-Q 法 32等 , 由于这些技术灵敏度高、操作流程简单、设备和试剂要 求相对较低

21、、集通用性和特异性于一身 , 便于一般实验室开展。 后 两者 miRNA 检测技术都是以荧光定量 PCR 技术为基础的。5.1探针定量 PCR 检测技术探针定量 PCR 检测技术主要有 stem-loop, key-like以及 Ligation Assay 技术。 stem-loop 与 key-like 技术的原理基本相同。但两者之间还 有一些区别。首先,逆转录引物有区别, stem-loop 技术的逆转录引物为 5 -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACNNNNNN- 3, 由 44个碱基组成 , 其形成互补双链的 stem 部分由 1

22、4对互补碱基构成 , A=T和 G=C对数目相同 , 有 6个碱基与成熟 miRNA 互补, key-like 技术的逆转录 引物为 5 -CGCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATACGCGNNNNNNNN- 3, 由 35个 碱基组成 , 其形成互补双链的 stem 部分由 4对互补碱基构成 , 均为 G=C, 有 8个碱基与成熟 miRNA 互补。再者,就是探针的区别, stem-loop 技术的 探针有 8个左右的碱基与成熟 miRNA 互补 , 而 key-like 技术的探针只有 3个碱基与成熟 miRNA 互补 , 但 stem-loop 技术探针的发光基团位于

23、与反向 引物配对的一端 , 而 key-like 技术探针的发光基团位于与 miRNA 配对的一 端。最后,还有正向引物的区别, stem-loop 技术的正向引物在设计时为了 让探针与更多的 miRNA 配对 , 有意识地让引物向外滑动了一些碱基 , 而 key-like 技 术 的 正 向 引 物 则 基 本 上 是 miRNA 序 列 。 另 外 就 是 连 接 法 (ligation Assay , 这中技术与前两种检测技术相比,原理略有不同。连 接法首先利用 8个左右的与成熟 miRNA 互补的短核苷酸链逆转录合成单链 cDNA, 在利用包含通用序列和 miRNA 特异序列的左、 右

24、核苷酸链与 miRcDNA 互补配对 , 并用 T4连接酶补平缺口 , 形成一条完成的 miRcDNA 链 ; 再利用 根据 miRNA 序列设计的探针和左、右核苷酸链前端预置的正反向引物进行 实时定量 PCR 扩增 , 收集荧光信号 , 获得 miRNA 的表达量。如图 7是三种 探针定量 PCR 的 miRNA 检测技术。 图 7 基于 PCR 和探针的 3种 miRNA 检测方法示意图5.2荧光染料 PCR 定量检测技术荧光定量 PCR 定量检测 miRNA 技术又可分为 polyA 聚合酶加尾法 ( polyA tailing assay , 引 物 延 伸 法 ( prmier ex

25、tension assay , Multiplexed RT法 (multiplexed RT assay以及 miR-Q 法 (miR-Q assay。 polyA 聚合酶加尾法是在成熟的 miRNA 的 3端加上一个 poly(A尾巴,形 成一个近似 mRNA 的结构,然后设计一个带有 poly(T的逆转录引物,再以 miRcDNA 为模板,利用 miRNA 特异的反向引物和带有 poly(T的通用正向逆 转录引物以及 SYBR Green进行 qPCR 扩增。引物延伸法引进了一种新的寡 聚核苷酸锁核酸(locked nucleic acid LNA 。该方法首先利用逆转录引 物,逆转录合

26、成 miRcDNA ,然后利用逆转录引物 5端预置的通用正向引物 和包含两个锁核酸且与 miRcDNA 互补配对的反向引物进行实时定量 PCR 扩 增,确定 miRNA 的表达量。 Multiplexed RT法不同于其他方法的最大特点 就是取消了通用引物的正向和反向 qPCR 引物,使得每个 miRNA 都具有特异 的逆转录引物和 qPCR 的正向和反向引物,这种方法的基本原理和引物延伸 法相似。 Multiplexed RT 法首先将需要研究的所有 miRNA 的特异 RT引物等量混合 , 构建一个 RT 引物库进行逆转录合成 miRcDNA, 然后给每一个不同 的 miRNA 设计特异的

27、正反向引物进行 qPCR 扩增。 miR-Q 法的逆转录引物 RT6-miR-x 由 2部分组成 , 其 3端为与 miRNA 互补的碱基序列 (约 6nt, 另 一部分为通用引物 MP-fw 序列。在进行 qPCR 扩增时,需要另外引入一个包 含寡聚核苷酸链 short-miR-x-rev, 其 3端为 miRcDNA 的互补序列 , 5 端为通用引物 MP-rev 序列。图 8是 SYBR Green荧光染料定量 PCR 技术的 四种 miRNA 检测方法的原理图。图 8 SYBR Green荧光染料定量 PCR 技术的四种 miRNA 检测方法示意图 6小结荧光定量 PCR 的发明,使得

28、实时检测 PCR 扩增产物成为了可能,实现 了从粗略定量、半定量到相对定量、绝对定量的跨越。通过设计针对目的 基因的特异性引物和探针 并优化反应体系和控制反应条件 可以成功地建 立快速灵敏特异的荧光定量 PCR 检测方法实现大样本同时检测,节省大量 的时间和反应成本。目前, miBase 数据库公布了近 15000条 miRNA 序列, 但多数 miRNAs 参与生命活动的分子机制还有待研究。近年来 , 人们把研究 的重点越来越多地放到了 miRNAs 参与基因表达调控的分子机制上。因此, 了解和掌握 miRNAs 的定量检测技术对研究其具体生命活动过程中得表达量 进行检测,成为研究 miRN

29、As 作用机制的基础。荧光定量 PCR 成为了此方面 研究的重要工具。参考文献1赵焕英 , 包金风 . 实时荧光定量 PCR 技术的原理及其应用研究进展 J.中国 组织化学与细胞化学杂志 ,2007,16(4:492-497.2 Wheeler BM, Heimberg AM, Moy VN, et al The deep evolution of metazoan microRNAs. Evol Dev, 2009,11:50-68.3 SunkarR, Jagadeeswaran G. In silico identification of conserved microRNAs in l

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