阳离子聚合物介导的体外培养兔角膜内皮细胞基因转移

1、阳离子聚合物介导的体外培养兔角膜内皮细胞基因阳离子聚合物介导的体外培养兔角膜内皮细胞基因转移转移作者：张林，郝兆芹 作者单位：(西安交通大学医学院第一附属医院眼科，陕西西安 710061)【摘要】 目的 观察非病毒载体阳离子聚合物(SofastTM)介导的编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的 pEGFPN1 和 pIREEGFP 两种质粒对体外培养的兔角膜内皮细胞(RCEC)的转染效率和转染前后细胞 Na+K+ATPase 活性变化，探索最优的体外 RCEC 非病毒载体基因转移条件。方法 消化法原代培养 RCEC，SofastTM 与 pEGFPN1 和 pIREEGFP 两种质粒按不同比例混

2、合，介导此两种质粒转染 RCEC，分别比较各质粒不同时间的转染效率，并检测转染与未转染细胞 Na+K+ATPase 的活性以确定基因转移对 RCEC 活性的影响。结果SofastTM 与质粒(pEGFPN1 和 pIREEGFP)按不同比例转染 RCEC 后，24-48h均有 EGFP 的表达。SofastTMpEGFPN1=3.21 组在转染后 48h 时转染效率最高(P0.05)，为 3.6%。SofastTMpIREEGFP=3.21 组在转染后 24h 时转染效率最高(P0.05)，为 3.5%。转染与未转染组细胞数和细胞Na+K+ATPase 活性均无明显差异。结论 SofastTM

3、 可有效介导以 pEGFPN1和 pIREEGFP 为载体的外源基因向体外培养的 RCEC 转移，且基因转移后 RCEC活性不受影响。【关键词】【关键词】 角膜内皮细胞角膜内皮细胞; ;阳离子聚合物阳离子聚合物; ;基因转移基因转移;Na+;Na+K+K+ATPaseATPaseTransferring gene to rabbit corneal endothelial cellsin vitroby cationic polymerZhang Lin, Hao Zhaoqin(Department of Ophthalmology, the First AffiliatedHospital

4、,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061,China)ABSTRACT: Objective To observe the transfection efficiency oftransferring plasmids pEGFPN1 and pIREEGFP encoding enhancedgreen fluorescent protein (EGFP) to rabbit corneal endothelial cells(RCECs) by cationic polymer and the change of ce

5、ll activity bydetecting the activity of Na+K+ATPase. Methods RCEC was culturedby digestion and identification by neurone specific enolase(NSE)stain. Sofast TM mediated plasmid pEGFPN1 and pIREEGFP totransfect RCECs and we compared the transfection efficiency atdifferent time and in different groups

6、by calculating the number offluorescent cells. We observed the activity change of transfectionand nontransfection RCEC by detecting the activity ofNa+K+ATPase. Results After pEGFPN1 and pIREEGFP transfectedRCEC with Sofast TM by different ratio, RCEC expressed EGFP in 24-48h.After transfection 48h t

7、he group of SofastTMpEGFPN1=3.21 hadthe max transfection efficiency 3.6% and the max transfectionefficiency of group SofastTMpIREEGFP =3.21 was 3.5%, at 24hafter transfection. There were no obvious differences between thetransfection and nontransfection groups of cell number and activityof Na+K+ATPa

8、se. Conclusion Sofast TM can mediate exogenous genetrasfering to RCEC effectively. pEGFPN1 and pIREEGFP are thesuitable nonvirus vectors for gene transferring to RCECs.KEY WORDS: corneal endothelial cells; cationic polymer; genetransfer; Na+K+ATPase角膜内皮层是位于角膜内面的细胞单层，是角膜基质与房水的分界，其屏障及泵功能对于保持角膜的透明性、基质的

9、脱水状态及角膜正常厚度起着关键作用。人角膜内皮细胞(human corneal endothelial cell, HCEC)增殖能力有限，如何有效提高 HCEC 的增殖是进行 HCEC 移植和构建组织工程化角膜12的关键。基因转移技术可将外源基因转入正常细胞，通过外源基因的表达来改变细胞的一些生理特性，进而达到促细胞增殖、诊断和治疗疾病的目的，正逐步应用于实验研究和临床。本实验通过 SofastTM 介导编码增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的 pEGFPN1 和 pIREEGFP 两种质粒转染兔角膜内皮细胞(rabbit

10、corneal endothelial cell, RCEC)，观察外源基因在 RCEC 的表达，检测转染组与未转染组 RCEC Na+K+ATPase 活性的变化，探讨最优的体外 RCEC 非病毒基因转移条件，为进一步将有促 HCEC 增殖和治疗功能的外源基因导入 HCEC 奠定基础。1 材料与方法1.1 实验动物 成年健康新西兰白兔 40 只(西安交通大学医学院实验动物中心提供),体重 1.5-2.0kg，均无眼疾，雌雄兼备。1.2 主要试剂及仪器 质粒 pEGFPN1 和 pIREEGFP 为天津医科大学李曦铭博士惠赠。质粒提取试剂盒购自北京天为时代科技有限公司。SofastTM 转染试

11、剂购自厦门太阳马公司。RPMI 1640 购自 GIBCO。胎牛血清购自杭州四季青公司。考马斯蓝蛋白测定试剂盒、超微量 ATP 酶测试盒由南京建成生物工程研究所提供。CO2 培养箱、倒置显微镜、手握式细胞匀浆器、722 分光光度计均由西安交通大学医学院遗传与分子生物学实验室提供。倒置荧光显微镜(OLYMPUS)由西安交通大学医学院第一附属医院泌尿外科提供。1.3 RCEC 体外培养 将兔经耳缘静脉空气栓塞处死后立即取出眼球，无菌条件下剪除眼球周围组织，庆大霉素生理盐水(400u/mL)冲洗，然后浸泡于庆大霉素生理盐水中 4保存。30min 后转入无菌间，在超净工作台内的解剖显微镜下，于角膜缘内

12、 1mm 处 360环形剪取角膜片，内皮面向上至培养皿中，沿角膜片边缘揭取后弹力层，内皮面向上置于预置 PBS 的另一培养皿中，经 PBS 漂洗后移入消化液(2.5g/L 胰蛋白酶和 0.2g/L EDTA 11 混合)中，37孵育 20-25min，倒置显微镜下观察内皮细胞松散，间隙变宽，部分脱落时，加入含 FBS的培养基终止消化，吹打使细胞脱落，将后弹力层剪碎后继续吹打，倒置显微镜下观察细胞已吹开，后弹力层已无细胞黏附时收集细胞悬液离心，1500 转离心 15min，PBS 重悬后再离心，血细胞计数板计数细胞，以 1105 个 cell/mL接种 24 孔板。1.4 RCEC 的鉴定 原代

13、接种细胞达到 80%融合时，用胰酶消化后做细胞爬片，免疫组化 SABC 法进行 NSE 染色，DAB 显色，镜检观察。1.5 转染及外源基因的表达 原代接种细胞贴壁后 48h 进行转染。SofastTM/DNA 按重量比 1.61、2.41、3.21、41 分别稀释混合后加入各孔，每种比率 5 个复孔。实验组分两大组：一组为质粒 pEGFPN1 组 (按比例由小到大分为 5 组);另一组为质粒 pIREEGFP 组(分 5 组)。不进行转染的 5孔为对照组。转染后 24、48h 时，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。每孔随机选取 5 个视野，分别计数光镜和倒置荧光显微镜下的细胞个数，然

14、后取平均值。1.6 Na+K+ATPase 活力的测定 将实验组中 EGFP 表达率最高的组与对照组细胞分别消化、离心，弃上清，留下层细胞，用 4生理盐水制备成 105cells /mm3 匀浆，用匀浆器在冰上进行破碎，制备细胞悬液备用。使用考马斯亮蓝试剂盒测定细胞悬液中蛋白含量。按照超微量 ATP 酶测试盒说明书进行ATP 酶检测。按以下公式计算:蛋白含量(g/L)=(测定管吸光度/标准管吸光度)标准管质量浓度(g/L)。Na+K+ATPase 活力(u/mg prot)=(测定管 A值-对照管 A 值)(标准管 A 值-空白管 A 值)标准管浓度(0.1mol/mL)6匀浆蛋白含量(mg

15、prot/mL)。1.7 统计学处理 实验数据采用 SPSS 13.0 软件处理，统计数据用s 表示，采用重复测量(Repeated measures)中最小显著法(LSD)进行统计学分析。2 结果2.1 倒置显微镜下观察原代 RCEC 的生长状况 原代接种后 4-6h 细胞贴壁，呈圆形，胞浆透亮，核居中(图 1);24-48h 细胞由圆形逐渐伸展变成不规则形;48h 后细胞逐渐变成规则的多边性，核圆、居中，呈集落状生长(图 2);至6-7d 时各集落融合成细胞单层，细胞排列紧密，呈典型的铺路石样(图 3)。2.2 NSE 染色 RCEC 经 NSE 染色，苏木素复染，DAB 显色后，可见胞浆

16、内粗大的棕色颗粒，胞核蓝色，呈 NSE 阳性表达(图 4)。证实本实验所培养的细胞为神经脊来源的 RCEC。2.3 外源基因的表达分析 因各孔接种细胞数相等，所以可用荧光细胞个数代表转染效率进行检验，以下结果均以荧光细胞个数为基础。SofastTM 与质粒(pEGFPN1 和 pIREEGFP)按不同比例转染 RCEC 后，24-48h 均有 EGFP 的表达，对照组未见表达 EGFP 的细胞。不同比例的 SofastTMpEGFPN1 各组间转染效率存在差别(P0.001)，各组间多重测量表明 4.01 组与其他三组转染率均有明显差异(P0.001)，其他三组间的转染率无明显差异(P1.07

17、);不同时间，转染效率不同(P0.001);分组与转染时间间有交互作用(P0.05);SofastTM：pEGFPN1=3.21 组在转染后 48h 时转染效率最高，为3.6%(光镜下每视野细胞计数平均为 200 个)，其 95%可信区间为(6.859，9.541)(图 5，表 1)。不同比例的 SofastTMpIREEGFP 各组间转染效率存在显著差异(P0.001)，各组间多重测量表明 3.21 组的转染率与其他三组有显著差异(P0.05)，其他三组间的转染率无明显差异(P0.181);不同时间，转染效率无显著差异(P=0.192);分组与转染时间间有交互作用(P0.05，表 3)。表

18、2 pIREEGFP 组 24、48h 时转染阳性 RCEC 数(略)Table 2 The number of transfection RCEC, after transfection 24hand 48h in pIREEGFP groupNote: Letter b indicates the group (SofastTMpIREEGFP=3.21)is different from the others表 3 对照组与实验组细胞数和细胞 Na+K+ATPase 活性(略)Table 3 The number of RCECs and the activity of Na+K+ATP

19、aseof RCECs in different groups*P0.05 vs. control3 讨论角膜内皮细胞(corneal endothelial cell, CEC)的体外培养方法已基本建立，较常用的有组织贴片培养法、揭膜法和酶消化法。组织贴片培养法最简单但易引起上皮和基质细胞的混入，揭膜法获得细胞纯但易污染，消化法在角膜材料较多时可一次提供大量细胞，但易对细胞造成损伤。本实验对消化法进行了改良，采用单纯消化配合剪切的方法既易于细胞自后弹力层脱落保证足够的细胞量，又避免酶对细胞过度损伤。经改良消化法原代培养的 RCEC 4-6h 贴壁，24-48h 时 RCEC 由圆形逐渐伸展为

20、不规则的多边形，48h 后变为规则的多边形，6-7d 融合成细胞单层，呈典型的铺路石样，胞浆透亮，核居中。虽然细胞未形成典型的六边形形态，但研究3已证实 RCEC 的活性与功能并不影响。NSE是神经来源组织所表达的一种特异性酶4。大多学者认为，CEC 来源于神经脊，故可将 NSE 作为一种鉴定 CEC 的标志酶。RCEC 经 NSE+苏木素复染后，可见胞浆内粗大的棕色颗粒，胞核呈蓝色，呈 NSE 阳性表达。证实本实验所培养的细胞为神经脊来源的 CEC。HCEC 培养是进行 HCEC 移植和构建组织工程化角膜的基础。因为 HCEC 体外增殖能力有限, 以往只是在培养基中添加促细胞增殖的生长因子，

21、如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等，但其促增殖效果并不理想。近年来基因转移技术正作为一种全新的方法，逐步应用于试验研究及临床疾病的诊断和治疗。基因转移的载体有病毒与非病毒载体之分，病毒载体转染效率高，传统的基因转移多以病毒载体为主，如 Aboalchamat5和 Bwdnarz 等6先后用病毒载体将 SV40 T 抗原转入 HCEC 获得了永生化的 HCEC;随后 Shin等7又用 HPV E6E7 原癌基因建立 RCEC 细胞系，并检测到 Na+/K+ ATP 活性增高;Hsiao 等8用重组表达 SV40 T/t 抗原的腺病毒载体转染 HCEC，发现可提高创伤愈合力和增殖能力，转染细胞可

22、保留形态学特征;Liu 9等用重组腺病毒介导酸性成纤维生长因子对 HCEC 进行转染，发现可显著促进 CEC 的增殖能力;Tsai 等10发现诱导型携带转基因的腺相关病毒(rAAV)载体可稳定携带转基因，并对 RCEC 功能无损伤。肿瘤病毒或致瘤病毒载体虽然转染效率高，但可使转染细胞丢失一些生物学特性，并面临致瘤的危险，而非病毒载体虽然转染效率低，但可保持细胞的正常生理功能。越来越多的学者将目光移到非病毒载体上。目前非病毒载体介导的对正常细胞进行的基因转移的有关报道大多用的是脂质体，其原理是脂质体与 DNA 质粒利用它们之间的静电作用形成复合体，此复合体再与细胞表面形成静电作用，进入细胞内。H

23、art 等11证明了脂质体载体可以转染兔角膜内皮和上皮细胞，但是其转染效率较病毒载体低12。阳离子聚合物工作原理类似于脂质体,主要是在带有阳离子的聚合物和充有阴离子的 DNA 之间形成复合物，然后吸附到细胞表面进入细胞内，其转染效率也相对较低。但是阳离子聚合物有利于保护 DNA 免受内核体的破坏13，且价格较低。因此本试验选用阳离子聚合物 SofastTM。pEGFPN1 和 pIRESEGFP 均为较常用的携带外源基因的质粒。pEGFPN1 适于携带较短基因片段而pIRES2EGFP 适于携带较大片断，且二者都有报告基因 EGFP，可直接在荧光显微镜下观察报告基因表达情况。本试验选用阳离子聚

24、合物 SofastTM 介导pEGFPN1 和 pIRESEGFP 转染 RCEC，结果表明其可有效介导外源基因转染RCEC，转染细胞与未转染细胞的数量及 Na+K+ATPase 活性基本一致，证明阳离子聚合物介导的基因转移并不影响 RCEC 的生物学活性，无毒副作用，可用于 CEC 的基因转移和治疗。角膜内皮基因转移是角膜内皮基因治疗的基础，通过基因转移对角膜移植前供体进行基因修饰可提高 CEC 功能，降低术后排斥反应的发生;通过基因转移促进 CEC 增殖可直接体内治疗因角膜内皮损伤所致的角膜病变，从而代替穿透性角膜移植术，降低排斥反应，克服术后散光、新生血管以及供体不足等缺点。该实验方法的

25、建立，为进一步寻找最佳基因转入载体，开展 CEC 的基因转移和治疗打下良好基础，对 CEC 移殖的临床应用和角膜病的基因治疗有很好的应用前景。【参考文献】1Zieske JD, Mason VS, Wasson ME, et al. Basement membraneassembly and differentiation of cultured corneal cells: importance ofculture environment and endothelial cell interaction J. Exp CellRes, 1994, 214(2):621633.2Orwin E

26、J, Hubel A. In vitro culture characteristics of cornealepithelial, endothelial, and keratocyte cells in a native collagenmatrix J. Tissure Eng, 2000, 6(4):307319.3傅瑶，范先群，刘伟,等. 以羊膜为载体培养角膜内皮细胞的实验研究J. 眼科研究, 2003, 21(2):147149.4毛羽翔，杨华胜. 神经元特异性烯醇化酶检测在眼科的临床意义 J.国外医学眼科学分册, 1997, 21(2):120123.5Aboalchamat B

27、, Engelmann K, Bohnke M, et al. Morphological andfunctional analysis of immortalized human corneal endothelial cellsafter transplantation J. Exp Eye Res, 1999, 69(5):547553.6Bednarz J, Teifel M, Friedl P, et al. Immortalization of humancorneal endothelial cells using electroporation protocol optimiz

28、edfor human corneal endothelial and human retinal pigment epithelialcells J. Acta Ophthalmol Scand, 2000, 78(2):130136.7Shin JS, Jang IK, Kim JC. Development and characterization ofa rabbit corneal endothelial cell line J. Jpn J Ophthalmol, 2004,48(5):454459.8Hsiao CH, Sah WJ, Soya K, et al. Effects of SV40 T antigentransduction on human corneal endothelial cell wound healing in vitroJ. J Oc