木黄酮对小鼠胰岛β细胞膜电位的影响-医药卫生论文

1、木黄酮对小鼠胰岛细胞膜电位的影响-医药卫生论文        作者摘要：赵玉峰，朱运龙，胡玉珍，周京军，钟延清 【 染料木黄酮Effect of genistein on membrane potentials of mouse pancreatic cells in vitro【AbstractAIM摘要: To determine the effect of longterm inactivation of protein tyrosine kinases on pancreatic cells. METHOD

2、S摘要: Primarily cultured mouse pancreatic cells were pretreated by 0.1 mmol%26#12539;L-1 genistein for 12 hours. The membrane potentials of cells were recorded by using perforated patchclamp techniques with wholecell mode. RESULTS摘要: Genistein treatment significantly decreased the resting membrane po

3、tentials of cells under the condition of both 2 mmol%26#12539;L-1 glucose and 0.2 mmol%26#12539;L-1 diazoxide, the opener of KATP channels. After stimulated by 15 mmol%26#12539;L-1 glucose, normal cells depolarized with short latent periods and provided the bursts of action potentials. In contrast,

4、mouse cells treated by genistein had significant increase in latent periods before depolarization, significant attenuation of action potentials, and significant elevation in membrane potentials at interval of action potentials. CONCLUSION摘要: Longterm treatment with genistein impairs the responses of

5、 pancreatic cells to glucose, and it is indicated that decrease in tyrosine kinases activity causes the dysfunction of pancreatic cells.【Keywords genistein; pancreatic cells; membrane potentials【摘要 目的摘要： 观察长期降低蛋白酪氨酸激酶活性对胰岛细胞的影响. 方法摘要： 原代培养的小鼠胰岛细胞被0.1 mmol%26#12539;L-1木黄酮（蛋白酪氨酸激酶抑制剂）处理12 h. 采用穿孔式全细胞记

6、录方法记录胰岛细胞膜电位的变化. 结果摘要： 在2 mmol%26#12539;L-1葡萄糖条件下以及0.2 mmol%26#12539;L-1二氮嗪（KATP通道开放剂）的功能下，木黄酮处理组细胞的静息电位均较对照组明显升高. 在15 mmol%26#12539;L-1葡萄糖的刺激下，小鼠正常胰岛细胞经短暂的潜伏期后发生往极化，爆发动作电位，而木黄酮处理组细胞的往极化潜伏期明显延长，动作电位幅度明显减弱，动作电位间期的膜电位明显抬高. 结论摘要： 木黄酮长期处理可损害小鼠胰岛细胞对葡萄糖的反应，提示蛋白酪氨酸激酶活性降低可能是胰岛细胞功能障碍的重要原因. 【 染料木黄酮；胰岛细胞；膜电位0引

7、言葡萄糖引发胰岛素分泌的过程是摘要：在胰岛细胞，葡萄糖代谢产生的ATP封闭ATP敏感性钾通道（KATP通道），引起细胞往极化，进而激活电压依靠性钙通道，引起Ca2+内流. 胞内Ca2+浓度升高激发胰岛素分泌1. 目前已知蛋白酪氨酸激酶在维持胰岛细胞正常功能中具有重要功能2. 蛋白酪氨酸激酶抑制剂木黄酮急性处理胰岛细胞可引起细胞电活动和胰岛素分泌的改变3. 但是，长期降低胰岛细胞中蛋白酪氨酸激酶活性对葡萄糖引起的胰岛细胞电活动的影响尚不清楚. 我们用蛋白酪氨酸激酶抑制剂木黄酮预处理原代培养的小鼠胰岛细胞12 h后，记录了小鼠胰岛细胞在静息状态下以及受葡萄糖刺激后其膜电位的变化.1材料和方法1.1

8、材料雄性C57BL/6J小鼠10只，年龄1012 wk，体质量2025 g，由第四军医大学动物实验中心提供. 电生理实验所用设备为Axon公司产品. 木黄酮以及其他所有实验用试剂均购自Sigma公司.1.2方法1.2.1小鼠胰岛细胞原代培养C57BL/6J小鼠被脱臼正法. 沿胆总管注射型胶原酶液进胰腺. 分离胰腺，37消化15 min. 振摇分散胰腺组织，用密度梯度离心法收集胰岛. 胰岛用蛋白酶消化分散为单个细胞4. 胰岛细胞种植于35 mm塑料培养皿中，培养在RPMI1640培养液中. 液中加进终浓度为100 mL%26#12539;L-1的胎牛血清，1×105 U%26#1253

9、9;L-1的青霉素和1×105 U%26#12539;L-1的链霉素. 细胞随机分为两大组，一组为处理组，用0.1 mmol%26#12539;L-1木黄酮处理12 h，一组为对照组. 在实验记录时每组细胞又分为两组，一组用于静息电位记录，一组用于观察葡萄糖诱导的膜电位变化. 每组记录细胞数为6个.1.2.2电生理实验采用穿孔式全细胞记录的方法记录胰岛细胞膜电位的变化. 实验中通过灌流系统给药. 电极电阻在布满电极内液后为35 M. 电信号采集用Axopatch 200A放大器，数据采集用Axoscpoe8.2软件系统. 电极和细胞间的巨阻抗（G）封接形成后，细胞被钳制于-70 mV

10、，补偿电极的电容电流. 在示波器上监测细胞穿孔进展，串联阻抗小于25 M被视为细胞穿孔良好，补偿细胞的串联阻抗和细胞电容电流，形玉成细胞钳制状态. 膜电位记录时，细胞被钳制于-70 mV，待形玉成细胞状态后，静置细胞10 min. 然后转变至电流钳制状态，开始信号采集. 细胞记录用细胞外液成分为（mmol%26#12539;L-1）摘要: NaCl 142.0, KCl 4.7, CaCl2 2.6, MgSO4 1.2, KH2PO4 1.2, NaHCO3 2, HEPES 5, Glucose 2 (pH=7.4). 细胞内液的成分为（mmol%26#12539;L-1）摘要: K2SO

11、4 76, KCl 10, NaCl 10, MgCl2 1, HEPES 10, Sucrose 36 (pH 7.3). 细胞内液中加进终浓度为0.24 g%26#12539;L-1的两性霉素B以在细胞膜上穿孔形玉成细胞钳制.统计学处理摘要：各组数据以x±s表示. 采用Wilcoxon秩和检验分析对照组和处理组之间的差异，以P%26lt;0.05为有明显性差异.2结果2.1木黄酮处理减弱小鼠胰岛细胞的静息电位在2 mmol%26#12539;L-1葡萄糖状态下，木黄酮处理组的小鼠胰岛细胞的膜电位较正常对照组明显减小对照组（-58.9±1.35） mV vs处理组（-47

12、.5±5.18） mV, P%26lt;0.01, n=6. 在2 mmol%26#12539;L-1葡萄糖的基础上加进0.2 mmol%26#12539;L-1 二氮嗪后（Diazoxide, KATP通道开放剂），正常小鼠胰岛细胞的膜电位增加到（-75.2±2.15） mV，木黄酮处理组细胞的膜电位增加到（-54.5±2.78） mV，较对照组仍然明显减小（P%26lt;0.01, n6, Fig 1）. 2.2木黄酮处理损害小鼠胰岛细胞对葡萄糖的反应在给予15 mmol%26#12539;L-1葡萄糖刺激后，小鼠正常胰岛细胞经过短暂的潜伏期后，其膜电位开始往

13、极化，逐渐升高，并变得不稳定，出现小的波动. 往极化达到近-40 mV时，爆发出明显的动作电位. 动作电位由快速往极化和快速复极化两相组成，动作电位往极化达0 mV左右，时程为80 ms. 动作电位间期的膜电位维持于-40 mV左右. 动作电位发生频率在不同的细胞变化极大，本实验所记录的正常胰岛细胞的动作电位发生的频率在120次%26#12539;min-1到240次%26#12539;min-1之间（Fig 2A）. 木黄酮处理的胰岛细胞在受到15 mmol%26#12539;L-1葡萄糖刺激后，往极化的潜伏期较正常细胞明显延长. 往极化至-40 mV时，处理组细胞发生动作电位，但其幅度较对

14、照组明显减小. 动作电位间期的膜电位不能维持于-40 mV左右，而是进一步往极化达到-20 mV左右（Fig 2B）. 两组胰岛细胞在葡萄糖刺激下的膜电位变化的统计分析见Tab 1.图1图2(略)表1木黄酮处理对葡萄糖诱导的小鼠胰岛细胞膜电位变化的影响(略)3讨论KATP通道是维持胰岛细胞膜电位的关键通道，KATP通道的多少和开放状态决定了胰岛细胞的静息电位1. 木黄酮处理的胰岛细胞的静息电位较正常对照组明显减小. 在用0.2 mmol%26#12539;L-1二氮嗪将KATP通道充分开放后，木黄酮处理组胰岛细胞的静息电位仍然较正常对照组明显减小. 这说明木黄酮处理可减少小鼠胰岛细胞上的KAT

15、P通道. 2型糖尿病动物的胰岛细胞上KATP通道的表达明显减少，其原因尚不清楚5. 我们的实验提示，蛋白酪氨酸激酶的活性降低可能是2型糖尿病中胰岛细胞上KATP通道减少的重要原因.在木黄酮处理的胰岛细胞，葡萄糖刺激引起往极化的潜伏期明显延长. 葡萄糖激酶活性的降低很可能是潜伏期延长的原因. 葡萄糖激酶是葡萄糖代谢中的关键酶，其活性和表达受胰岛素的调节6. 木黄酮是蛋白酪氨酸激酶的抑制剂，可阻断胰岛素的信号传导，从而降低葡萄糖激酶的表达7,8. 葡萄糖激酶活性降低使葡萄糖不能被正常代谢从而抑制了ATP的产生. 因此，细胞不能迅速封闭KATP通道和发生往极化，刺激分泌偶联过程被延迟. 糖耐量异常以

16、及2型糖尿病患者进食后胰岛素分泌较正凡人滞后，也可能是由于酪氨酸激酶活性降低，胰岛细胞的反应潜伏期延长所致.胰岛细胞具有兴奋性，其动作电位的往极化由Ca2+电流所致，复极化由电压依靠性K+电流所致9. 正常胰岛细胞具有典型的动作电位，而木黄酮处理组细胞的动作电位幅度减小，其主要原因很可能是电压依靠性钙电流的减小. 复极化过程严重受损也是动作电位幅度减小的一个原因. 木黄酮处理的胰岛细胞在动作电位间期的膜电位不能维持于-40 mV左右，而是逐渐升高，这说明电压依靠性钾电流在木黄酮处理的胰岛细胞上减小. 这种变化必然减弱葡萄糖刺激的细胞内Ca2+升高和胰岛素分泌的过程. 可见，木黄酮长期处理可以减

17、弱小鼠胰岛细胞上多种电流，并损害葡萄糖的代谢过程，从而损害小鼠胰岛细胞中葡萄糖引起的刺激分泌偶联过程. 这提示蛋白酪氨酸激酶活性降低可能是胰岛细胞功能障碍的重要原因.【参考文献1 Rorsman P. The pancreatic betacell as a fuel sensor摘要: an electrophysiologists viewpoint J. Diabetologia, 1997; 40(5)摘要:487-495.2 Persaud SJ, Harris TE, Burns CJ, Jones PM. Tyrosine kinases play a permissive ro

18、le in glucoseinduced insulin secretion from adult rat islets J. J Mol Endocrinol, 1999;22(1)摘要:19-28.3 Jonas JC, Plant TD, Gilon P, Detimary P, Nenquin M, Henquin JC. Multiple effects and stimulation of insulin secretion by the tyrosine kinase inhibitor genistein in normal mouse islets J. Br J Pharm

19、acol, 1995;114(4)摘要:872-880.4 Liu M, Shapiro ME. A new method for isolation of murine islets with markedly improved yields J. Transplant Proc, 1995;27(6)摘要:3208-3210.5 Stoffel M, Tokuyama Y, Trabb JB, German MS, Tsaar ML, Jan LY, Polonsky KS, Bell GI. Cloning of rat KATP2 channel and decreased expression in pancreatic islets of male Zucker diabetic fatty rats J. Biochem Biophys Res Commun, 1995;212(3)摘要:894-899.6 Postic C, Shiota M, Magnuson MA. Cellspecific roles of glucok