枸杞子多糖提取工艺优化及体外抗氧化活性研究

1、枸杞子多糖提取工艺优化及体外抗氧化活性研究                               作者：刘长建 姜波 刘亮 范圣第【摘要】  目的研究枸杞子多糖的提取及抗氧化活性。方法采用水提法提取枸杞子中的多糖，通过正交实验研究了固液比、提取温度、提取时间对枸杞子多糖提取得率的影响

2、，并进行了提取次数实验。采用羟基自由基、超氧阴离子自由基体系，对枸杞子多糖的抗氧化活性进行了研究，并与维生素C进行了比较。结果确立了水提法提取枸杞子多糖的最佳工艺条件为提取温度80，固液比130，提取时间3.5 h，提取2次。当多糖浓度达到229.5 g/ml时，清除率达到48.1%，维生素C的清除率为41.2%。对超氧阴离子自由基的清除率低于维生素C，当多糖浓度达到229.5 g/ml时，清除率达到13.5%，维生素C的清除率为48.6%。结论该方法简单、环保，枸杞子中多糖含量为8.34%。枸杞子多糖对这两种自由基均有不同的抑制作用。对羟基自由基的清除率高于维生素C。 【关键词】 

3、 枸杞子 多糖提取 正交实验 抗氧化活性枸杞子为茄科（Solanaceae）植物枸杞Lycium chinense Mill的成熟果实，是我国传统的滋补中药材。本草纲目中记载枸杞子具有坚筋骨、补精气诸不足、明目安神、令人长寿等功效1。近年来的研究发现，植物多糖具有抗肿瘤、增强机体免疫力等功效，已是当前国内外研究的热点25。目前人们对枸杞子多糖进行了较广泛的研究，发现枸杞多糖具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血脂、降血糖、抗疲劳、护肝、防辐射、抗缺氧等功效68，同时对多糖的分离与纯化进行了一些研究9，10，但对提取的工艺条件研究较少。本文对影响枸杞子多糖提取因素进行了正交实验，优选出最佳的枸

4、杞子多糖提取的工艺参数，同时进行了枸杞子多糖的体外抗氧化活性研究，以期为研究开发枸杞子多糖新的药物功能及保健食品提供基础数据。1    材料与方法1.1   仪器与试剂上海尤尼柯仪器有限公司产WFJ2100型分光光度计；上海安亭精密仪器厂产TDL80-28台式离心机；所用试剂均为分析纯试剂。1.2   药材  枸杞子，原产宁夏，购于大连开发区。1.3   枸杞子多糖的提取1.3.1   枸杞子多糖提取的工艺流程及方法在已有其它种类多糖提取方法11的基础上，利用水提的方法，采用

5、正交实验对枸杞子多糖的提取条件进行优化，以确立最佳工艺条件。枸杞子多糖提取的工艺流程见图1。图1  枸杞子提取工艺流程示意图（略）    准确称取已于70烘干并粉碎的枸杞子2 g于三角瓶中，按设计好的正交实验条件在恒温水浴中进行提取，然后将其以4 000 r/min离心18 min，得上清液，经浓缩，再加入5倍体积的乙醇，摇匀后，在4冰箱中放置过夜，以4 000r/min离心20 min。沉淀经干燥后得到粗多糖。采用硫酸苯酚法11测定所提取的枸杞子多糖中多糖含量，然后根据所用枸杞子的质量（2g）出枸杞子中多糖得率。1.3.2   正交

6、实验选用L9（33）正交实验，确定提取枸杞子多糖的最佳工艺参数，水平因素见表1。表1  正交水平（略）1.3.3  多糖含量测定采用硫酸-苯酚法测定提取的枸杞子多糖含量11，葡萄糖标准曲线的相关系数为0.998 8，线性方程为Y=0.007X。    由标准曲线查出样品中多糖浓度，由下列公式计算样品枸杞子中多糖含量。    多糖含量（%）=样品浓度×稀释倍数×样品体积多糖试样质量×100%    枸杞子多糖得率（%）=计算测得多糖的质量枸杞子样品质量（2g

7、)×100%1.4  体外抗氧化活性121.4.1  羟基自由基体系利用Eenton体系测定枸杞子多糖对亚铁离子催化过氧化氢产生·OH的清除能力。由于·OH可特异地使番红花红褪色，根据褪色程度用比色法测量·OH含量。每支试管分别加入0.15 mol/L pH=7.4磷酸缓冲液1.5 ml，260 g/ml番红花红0.2 ml。1.0 mmol/L EDTA- Na2-Fe2+ 0.7 ml，再分别加入一定浓度各级多糖试样1.0 ml,最后加入2H2O20.8 ml，混匀后于37水浴保温30 min。空白以蒸馏水代替试样，对照组则以蒸馏

8、水代试样和EDTA-Na2-Fe2+于520 nm测吸光度值，并以Vc作对比。    清除率E（%）=（A样品-A空白）/（A对照-A空白）×1001.4.2  超氧阴离子体系采用邻苯三酚自氧化法，在一定条件下，邻苯三酚能够自氧化产生·O2-，加入一定量的多糖液可对·O2-产生不同的抑制作用，进而导致光吸收值的变化。取0.05 mol/L pH 8.2 Tris-HCl缓冲液5 ml于试管中，分别加入1 ml一定浓度的各级多糖试样液，置于25水浴中预热20 min，再加3 mmol/L邻苯三酚0.4 ml，混匀，于25水浴中

9、准确反应4 min，立即用浓HCl 0.5 ml终止反应，并在320 nm处测吸光度。空白对照组以相同体积Tris-HCl代替样品，每个试管做3个平行，取平均值，按下式计算清除率。    清除率E（）=（A对照-A样品）/A对照×100%2   结果与讨论2.1   枸杞子多糖提取2.1.1  正交实验结果正交实验提取的枸杞子多糖得率见表2。表2  正交实验结果（略）根据表2的极差分析可见，各因素对多糖得率的影响顺序为：B（温度） C（提取时间） A（固液比），说明在各因素中，水提温度对多糖提取

10、率影响最大，然后是提取时间，最后是固液比。因素A，B以第2水平，C以第3水平为最好。因此，可确定枸杞多糖的提取优化条件为A2B2C3，即最佳提取温度为80，最佳提取时间为3.5 h，最佳固液比为130。2.1.2   多糖提取次数实验称取枸杞子2 g，按正交实验优选的最佳工艺条件分别提取3次。实验结果见表3。1         表3  不同提取次数实验结果（略）由表3可以看出，第1次和第2次提取多糖得率较多，而第3次提取多糖得率较少，多糖得率不足0.1%，所以提取次数可选为2次。2.2

11、   体外抗氧化活性2.2.1  羟基自由基清除测定枸杞多糖对羟基自由基的清除能力，同时与相应浓度的维生素C作对照,实验结果见图1。图1  枸杞子多糖与维生素C清除羟基自由基结果（略）    由图1可见，对羟基自由基的清除作用，枸杞多糖的清除效果要好于等质量浓度的维生素C，当多糖浓度达到229.5 g/ml时，其清除率达到48.1%,维生素C的清除率为41.2。2.2.2   超氧阴离子清除测定枸杞多糖对超氧阴离子的清除能力，同时与等质量浓度的维生素C的对照。实验结果见图2。  

12、60; 由图2可知，枸杞子多糖对超氧阴离子自由基的清除作用不明显，在实验浓度范围内其清除率随着多糖浓度的增加非常缓慢，维生素C的清除效果明显高于枸杞子多糖。当多糖浓度为75.5 g/ml和229.5 g/ml时，其对超氧阴离子自由基的清除率为13.4%和13.5%，相应浓度维生素C的清除率分别为36.5和48.6。图2  枸杞子多糖与维生素C清除超氧阴离子结果（略）3  结论    由正交实验可见，在影响枸杞子多糖得率3个主要因素中，温度的影响最显著，其次为提取时间，最后为固液比。由正交实验可知,枸杞子多糖水浸提法提取的最佳工艺条件为提取温度8

13、0，固液比130，提取时间3.5 h，提取次数为2次。在此条件下进行实验，枸杞子多糖得率为8.34%。对枸杞子多糖抗氧化活性研究表明，枸杞子多糖对羟基自由基的清除效果较好，其清除率高于维生素C，而对超氧阴离子自由基的清除率低于维生素C，在实验浓度范围内，其清除能力不随多糖浓度的增加而显著增高。【】  1 段昌令,乔善义,王乃利,等.枸杞子活性多糖的研究J.药学学 报，2001,36(3):196.2 韩果萍,段玉峰.我国天然活性多糖药理研究进展J.中药材,2003,26(2):138.3 韦 巍,李雪华.多糖的研究进展J.国外医学·药学分册,2005,32(3):179.4 吴梧桐,高美凤,吴文俊.多糖的抗肿瘤作用研究进展J.天然药物, 2003,1(3):182.5 王红英. 中药多糖研究进展J. 实用医技杂志, 2006,13(6):1021.6 朱彩平,张声华.枸杞多糖对高脂血症小鼠血脂及脂质过氧化的影响J.营养学报，2005, 27(1):79.7 苏 菁,徐宗佩.中药防治脂肪肝实验研究进展J.时珍国医国药，2006,17(7):1287.8 齐春会,张永祥,赵修南.枸杞粗多糖的免疫活性J.中国药与毒理学杂志，2001,15(3):180.9 罗