浅论吡咯喹啉醌对γ射线照射后AGS细胞抗氧化力的影响

1、浅论吡咯喹啉醌对射线照射后AGS细胞抗氧化力的影响 作者：邱秀芹，刘春亮，徐岚，赵俊宇，吴士良【摘要】 目的： 探讨吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)对60Co射线照射细胞清除自由基能力。方法： 培养AGS细胞至对数期，实验分为6组：正常培养未照射组、单纯照射组、PQQ培养12 h未照射组、PQQ培养4 h未照射组、PQQ培养12 h后照射组、PQQ培养4 h后照射组。60Co照射，剂量8Gy。照射后6,12,24 h测定细胞总抗氧化力（TAOC），SOD，MDA含量。结果： 与正常未照组比较，照射后6，12，24 h单纯照射组SOD，TAOC显着降低（P0

2、.05），MDA显着升高（P0.01）；与单纯照射组比较：PQQ培养的照射组SOD，TAOC显着升高（P0.01），除照射后6 h外MDA显着降低（P0.05）。结论： PQQ可通过增强细胞抗氧化能力，降低氧化水平，从而对辐射细胞起保护作用。 【关键词】 AGS细胞； 吡咯喹啉醌； 抗氧化力AbstractObjective: To investigate PQQ scavenging free radicals in cells by ray radiation.Methods： AGS cells were cultivated. There were 6 groups in our ex

3、periment: the normal group, simply irradiated group, nonirradiated group treated with PQQ by 12 hours, nonirradiated groups treated with PQQ by 4 hours, irradiated groups treated with PQQ by 12 hours, irradiated groups treated with PQQ by 4 hours. The radiation was 60Corays with the dose of 8Gy. Aft

4、er irradiated 6 h, 12 h, 24 h, the cells were measured of theses level: total antioxidation competence(TAOC),SOD,MDA. Results： The level of TAOC and SOD decreased (P0.05),and the level of MDA increased (P0.01)in simply irradiated groups after irradiated 6 h, 12 h, 24 h,in comparison with the normal

5、group. The level of TAOC and SOD increased (P0.01) in irradiated groups treated with PQQ in comparison with the simply irradiated group; and the level of MDA decreased (P0.05). Conclusion： PQQ can protect radiated cells,by strengthening antioxidative competence and lessening the oxidation of cells.K

6、ey wordsAGS cell; pyrroloquinoline quinone; antioxidation competence从食品辐照、医用射线到空间电离辐射，辐射无处不在。大剂量辐射可引起机体多种组织和器官的损伤，甚至诱发细胞突变、癌变、致死等严重后果。如何增强机体抵抗力，防止或减轻辐射对人体健康的危害，研究高效、低毒的辐射防护剂显得非常重要。 吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)是一种氧化还原酶辅基，作为电子的供体和受体参与氧化还原过程1。PQQ具有一些重要的生物活性和功能：如刺激微生物、人体细胞生长和植物发育等。本实验室已初步研究PQQ对高能

7、电子射线照射引起的大鼠皮肤损伤有一定的防护作用，PQQ能有效提高自由基清除酶系活性，部分清除电子直线加速器照射后产生的自由基2。本实验以胃癌细胞AGS为研究对象，通过检测60Co射线照射后AGS细胞中抗氧化能力及自由基含量的变化，探讨PQQ对细胞的辐照损伤效应的影响。 1 材料与方法 1.1 主要仪器和试剂 胃癌细胞系AGS购自上海生科院,本室培养；PQQ由上海复旦大学生物化学教研室惠赠；丙二醛(MDA)、总抗氧化力(TAOC)和超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；60Co照射装置由苏州大学核辐照中心提供。 1.2 细胞培养、实验分组与处理 胃癌细胞AGS培养在含1

8、0小牛血清的RPMI1640培养液中，置37 50 ml/L CO2培养箱中，保持饱和湿度，环境温度为25。取对数生长期的细胞，经台盼蓝染色，活细胞超过80者用于实验。实验分6组：正常未照射组（A组）、单纯照射组（B组）、PQQ培养12 h未照射组（C组）、PQQ培养4 h未照射组（D组）、PQQ培养12 h后照射组（E组）、PQQ培养4 h后照射组（F组）。PQQ溶解在无血清的RPMI1640培养基中，0.22 m孔径滤过除菌，4避光放置备用。PQQ在培养液中的终浓度为10 mol/L。取对数生长期细胞，接种于6孔培养板中，每孔达3106，贴壁过夜。C，E组于照射前12 h换含PQQ的培养液

9、，D，F组于照射前4 h换含PQQ的培养液，B，E，F组采用苏州大学核辐照中心60Co射线照射装置，剂量8 Gy，剂量率1 Gy/min进行单次照射。共做6批。 1.3 细胞SOD，TAOC，MDA测定 取对数生长期细胞，每孔3106细胞数接种于6孔培养板，贴壁过夜。按分组要求加入PQQ。细胞照射后6,12,24 h，0.25%胰酶消化,离心收集细胞，PBS洗2 次，弃洗液。取各组细胞加PBS 1 ml，Tris100裂解细胞，离心取上清液。用比色法按试剂盒说明测定SOD，TAOC，MDA含量。 1.4 统计学处理 实验结果用均数标准差(s)表示，数据处理用社会学统计程序包SPSS11.5软件

10、系统，经方差分析后，两两比较采用t检验。2 结 果2.1 60Co射线照射后不同时间点各组细胞SOD，TAOC含量变化 照射后6，12，24 h，B组细胞TAOC，SOD明显低于A组（P0.05）；C，D，E，F组细胞TAOC，SOD均显着高于A组（P0.05），C，D，E，F组均显着高于B组(P0.01)。照射前4 h和照射前12 h换PQQ培养液比较差异无统计学意义，PQQ培养的未照组与照射组细胞比较差异无统计学意义（表1，表2）。表1 PQQ对60Co射线照射AGS细胞TAOC 含量的影响，Tab 1 Effects of TAOC activity by PQQ 60Coray irr

11、adiation on AGS cells（略）；表2 PQQ对60Co射线照射AGS细胞TSOD 含量的影响，Tab 2 Effects of TSOD activity by PQQ 60Coray irradiation on AGS cells（略） 照后6，12，24 h，B，E，F组细胞MDA明显高于A组（P0.01）；照射后12，24 h，E，F组细胞MDA明显低于B组（P0.05）；各时间点C，D组细胞MDA与A组比较差异无统计学意义(表3)。表3 PQQ对60Co射线照射AGS细胞MDA含量的影响，Tab 3 Effects of MDA concentration by P

12、QQ 60Coray irradiation on AGS cells（略） 3 讨论 电离辐射对生物体可造成严重损害。电离辐射可直接作用于核酸、蛋白质及酶类，引起电离和化学键断裂，使分子变性和细胞结构破坏；也可以作用于机体内水分子，使其发生电离和激发，产生大量具有强氧化性能的自由基，间接使组织细胞变性、坏死，致使代谢紊乱，引起免疫、神经和内分泌系统功能障碍3。本研究显示8 Gy60Co射线照射AGS细胞后于6,12,24 h细胞SOD，TAOC均明显降低，MDA显着升高，细胞死亡增加，发生了明显的辐射损伤生物学效应。 吡咯喹啉醌为B族维生素4，Urakami等5用电子自旋共振(ESR)光谱法

13、分析证实PQQ具有很强的自由基清除能力，其清除自由基的能力比抗坏血酸高50100倍。对心肌的缺血再灌注实验表明PQQ是有效的自由基清除剂，是一种高效的心肌保护剂6；Tao等7研究表明PQQ能减轻过氧化对心肌细胞的线粒体渗透，降低过氧化脂质的含量；Ohwada等8研究表明PQQ能提高神经系统由于氧化压力导致的认知能力下降，能抑制由于氧化造成的神经细胞的死亡9。 有研究表明携带PQQ合成酶基因的大肠埃希菌具有抗辐射及抗氧化能力是通过PQQ直接清除活性氧自由基及调动其他自由基清除机制实现的10。本研究结果显示，照射前PQQ培养的AGS细胞TAOC，SOD含量于照射后6,12,24 h各时间点均明显高

14、于单纯照射组，照射前PQQ培养的AGS细胞MDA含量于照射后12,24 h明显低于单纯照射组，表明PQQ可提高细胞的抗氧化能力，降低自由基水平，保护辐照细胞免受自由基攻击，从而对细胞辐照损伤有一定的防护作用。同时，研究结果显示，PQQ处理的未照射AGS细胞TAOC，SOD含量于各时间点均明显增加，而MDA含量没有显着差异。表明PQQ也能增强正常细胞的抗氧化酶的合成，其具体机制有待进一步研究。【参考文献】 1Matsnshita K，Toyama H，Yamada M，et alQuinoproteins：structure，function，and biotechnological appli

15、cationsJAppl Microbiol Biotechnol，2002，58（1）：13-22 2吴祁生，王建浩，周迎会，等吡咯并喹啉醌对急性放射性皮肤损伤大鼠机体自由基的清除作用J江苏大学学报：医学版，2008，18 (5 )：403-4063Boucher D，Hindo J，Averbeck DIncreased repair of gammainduced DNA doublestrand breaks at lower doserate in CHO cellsJCan J Physiol Pharmaco1，2004，82(2)：125-132 4Kasahara T，Kat

16、o TNutritional biochemistry: A new redoxcofactor vitamin for mamalsJNature，2003，422（6934）：8325Urakami T，Yoshida C，Akaike T，et alSynthesis of monoesters of pyrroloquinoline quinone and imidazopyrroloquinoline, and radical scavenging activities using electron spin resonance in vitro and pharmacologica

17、l activity in vivoJJ Nutr Sci Vitaminol，1997，43(1)：19-336Zhu BQ，Zhou HZ，Teerlink JR，et alPyrroloquinoline quinone (PQQ) decreases myocardial infarct size and improves cardiac function in rat models of ischemia and ischemia/reperfusionJCardiovasc Drugs Ther，2004，18(6)：421-4317Tao R，Karliner JS，Simoni

18、s U，et alPyrroloquinoline quinone preserves mitochondrial function and prevents oxidative injury in adult rat cardiac myocytesJBiochem Biophys Res Commun，2007，363(2)：257-2628Ohwada K，Takeda H，Yamazaki M，et alPyrroloquinoline quinone (PQQ) prevents cognitive deficit caused by oxidativeStress in ratsJJ Clin Biochem Nutr，2008，42：29-349Nunome K，Miyazaki S，Nakano M，et alPyrroloquinoline quinone prevents oxidative stressinduced neuronal death pro