甲基硝基亚硝基胍诱发的遗传不稳定细胞DNA聚合酶βmRNA表

1、甲基硝基亚硝基胍诱发的遗传不稳定细胞DNA聚合酶mRNA表达水平研究*摘要目的和方法：本实验室曾报道，低浓度0.2 mol/L烷化剂甲基硝基亚硝基胍(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)可以诱导哺乳类细胞遗传不稳定状态。为明确其发生机制，本文利用定量RT-PCR方法，研究了该低浓度MNNG对人HeLa及猴肾vero细胞DNA聚合酶(pol ) mRNA表达水平的影响。结果：经0.2 mol/L MNNG 2.5 h处理后，HeLa细胞pol mRNA水平在624 h内升高约1倍；而vero细胞pol mRNA水平在1230 h内亦升高1倍左右。结

2、论：提示pol mRNA水平改变可能参与MNNG诱发细胞遗传不稳定的发生。主题词诱变；DNA聚合酶类；基因表达；聚合酶链反应 mRNA expression of DNA polymerase in MNNG induced genetically unstable cellsFENG Zhao-Hui, YU Ying-Nian, CHEN Xing-RuoDepartment of Pathophysiology and Laboratory of Molecular Biology, Zhejiang Medical University, Hangzhou (310031)Abstra

3、ct AIM and METHODS: It was reported from our laboratory that low concentration N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) could induce genetic instability in mammalian cells. To elucidate its mechanism, quantitative RT-PCR was used to study mRNA expression of DNA polymerase in MNNG induced genetical

4、ly unstable cells. RESULTS：It was demonstrated that mRNA level of polymerase increased by nearly one-fold in HeLa cells from the 6th to 24th hour after being treated with 0.2 mol/L MNNG for 2.5 h;and the same was demonstrated in vero cells from 12 th to 30 th hour after 0.2 mol/L MNNG treatment. CON

5、CLUSION：The alteration of polymerase expression might be involved in the genesis of MNNG induced genetic instability in mammalian cells.MeSHMutagenesis; DNA polymerase; Gene expression; polymerase chain reaction化学物质或离子辐射可以诱发哺乳类细胞遗传不稳定状态(genetic instability)，但其发生机制尚不明确1。本室证实低浓度0.2 mol/L烷化剂甲基硝基亚硝基胍(N-

6、methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)处理细胞2.5 h，可诱发细胞遗传不稳定状态产生2；同时有DNA复制保真度明显下降3，及许多基因表达水平的改变4；转录抑制剂可阻断该状态产生5。提示其产生与有关基因表达水平改变有关。许多研究提示DNA聚合酶(pol )可能与MNNG诱发细胞遗传不稳定有关。pol 具有较低的DNA复制保真度，及较强的跨损伤误性DNA修复等特性。MMS、 AAF、 H2O2、 TPA及大剂量MNNG(20 mol/L)可诱导细胞pol mRNA水平的改变；甲基亚硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea, MNU)诱导的小鼠

7、胸腺淋巴瘤细胞中发现有DNA复制保真度下降及pol mRNA水平升高8；对烷化剂耐受的肿瘤细胞中也发现pol 表达水平改变9。为明确MNNG诱发的遗传不稳定细胞中是否有pol 表达水平的改变，我们对0.2 mol/L MNNG处理后的人宫颈癌HeLa细胞，及猴肾vero细胞中pol mRNA水平进行了研究。材料与方法一、细胞培养及处理：单层生长的HeLa,vero细胞培养于含10%小牛血清的DMEM培养基(Gibco)中。用0.2 mol/L MNNG(Sigma, 0.1% 二甲基亚砜DMSO作溶剂)处理细胞2.5 h后，经彻底漂洗，加入新鲜培养基，分别培养一定时间，对照组细胞用0.1% D

8、MSO处理2.5 h。二、PCR引物合成：根据Genbank公布的人类基因序列，合成人pol 及2-微球蛋白基因(2m) 等二对PCR引物(上海细胞所)。其中pol 引物分别为：5-CTT TGA GAA GAA CGT GAG CC-3(正义)，5-CTC GTA TCA TCC TGC CGA AT-3(反义)，PCR产物长210 bp; 2m引物分别为：5-C ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA-3(正义)，5-C ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-3(反义)，PCR产物长120 bp。三、定量RT-PCR分析基因mRNA表达水平：用TRIZol试剂

9、(Gibco)按厂家说明书上方法提取HeLa细胞总RNA。取2 g细胞总RNA， 0.5 g d(N)6随机引物，200 mol/L-MLV逆转录酶(Promega)，25 L总体积，37反应1.5 h逆转录反应合成cDNA第一链。取对照组细胞逆转录产物2.5 L， 20 pmol pol 及内参照 2m基因PCR引物，总体积50 L，对两基因同时进行PCR扩增。扩增条件：94 1 min, 57 35 s, 72 1 min。从20个循环数起，每增加3个循环数进行一次PCR扩增，直至40个循环数为止。产物经3%琼脂糖凝胶电泳后，溴乙锭染色，紫外灯下拍照，对产物电泳条带进行光密度扫描，计算po

10、l 和2m条带光密度比值(OD pol/OD 2m)，以确定PCR定量扩增靶基因的合适循环数。分别取各处理组细胞逆转录产物2.5 L，严格按上述条件和选定的合适PCR循环数，对pol 和2m基因同时进行扩增。PCR产物按上述方法进行定量分析，pol 基因表达水平以pol 和2m PCR产物电泳条带光密度比值(OD pol /OD 2m)来表示。各样本至少重复3次RT-PCR过程。按上述方法，利用人2m， pol基因PCR引物对MNNG处理后的vero细胞中pol基因mRNA水平进行定量分析。结果以 2m基因为内参照，扩增对照组HeLa细胞中pol基因。对经溴乙锭染色的产物电泳条带进行光密度扫描

11、，发现从23至32个循环间，pol和2m基因PCR产物条带光密度比值(OD pol/OD2m)恒定。表明在此循环数范围内，pol和2m基因均呈指数扩增，适合作定量分析。故此选定27个循环数作为定量RT-PCR扩增的循环数(1)。Fig 1 RT-PCR products of DNA polymerase and 2-microglobin in HeLa cells after amplification with different PCR cycle numbers. Lane 1: pGEM-7zf(+)Hae marker. OD pol/OD 2m: Lane 2:0.584; L

12、ane 3:0.713; Lane 4:0.552; Lane 5:0.654; Lane 6:1.116;1经不同PCR循环数扩增后的HeLa细胞中DNA聚合酶和2-微球蛋白基因RT-PCR产物HeLa细胞经0.2 mol/L MNNG处理2.5 h后，分别于0， 6， 12， 24， 36 h，提取总RNA， 以2m基因为内参照，对pol 进行定量RT-PCR扩增。扩增条件同前，循环数为27个。产物电泳条带经光密度扫描，分别计算OD pol/OD 2m比值，每样本至少经3次定量RT-PCR分析。结果发现，pol在MNNG处理细胞后624 h间升高约1倍左右(2，表1)。Fig 2 RT-P

13、CR products of DNA polymerase gene in HeLa cells treated with 0.2 mol/L MNNG for 2.5 h. Lane 1: pGEM-7zf(+) Hae marker. Lane 2: control; Lane 37:0.2 mol/L MNNG2经0.2 mol/L MNNG 2.5 h处理后，HeLa细胞中DNA聚合酶基因RT-PCR产物表1经0.2 mol/L MNNG 2.5 h处理后的HeLa, vero细胞中DNA聚合酶基因mRNA表达水平Tab 1 mRNA expression of DNA polymer

14、ase in HeLa, vero cells after treatment of 0.2 mol/L MNNG for 2.5 h (s, n=3)OD pol/OD 2mControlTime after MNNG treatment(h)03612243036HeLa0.6280.1240.5970.136+1.1520.165*1.2130.173*1.0840.126*0.5870.078Vero0.4850.0860.4630.0620.3120.0740.4760.1050.9750.092*1.0130.081*0.9640.116*0.5100.075Quantitativ

15、e RT-PCR was used to amplify pol and 2m gene in cells. PCR products were electrophoresed and the bands were measured with optical density scanning. The expression levels of pol were expressed as the ratio of the bands of pol to that of 2m (OD pol /OD2m)*P0.05, vs control group利用人2m, pol基因PCR引物，对vero

16、细胞中相应基因进行扩增，发现其RT-PCR产物大小与 HeLa细胞中的大小完全一致。由于上述两基因所选定的PCR引物及扩增区域cDNA序列非常保守，在果蝇、小鼠、人不同真核生物中均有很高的同源性，故此认为所得产物即为2m,pol基因。发现从23至32个循环间，两基因均呈指数扩增，其PCR产物带光密度比值恒定。在此基础上，同样用27个循环进行PCR扩增，对MNNG诱发的遗传不稳定vero细胞pol mRNA表达情况进行分析，同样发现在0.2 mol/L MNNG处理后1230 h内pol mRNA水平升高约1倍(3，表1)。Fig 3 RT-PCR products of DNA polymer

17、ase gene in vero cells treated with 0.2 mol/L MNNG for 2.5 h. Lane 17: 0.2 mol/L MNNG; Lane 8: control; Lane 9: pGEM-7zf(+) Hae marker3经0.2 mol/L MNNG 2.5 h处理后，vero细胞中DNA聚合酶和RT-PCR产物讨论目前为止，在哺乳类细胞中已发现有五类核DNA聚合酶(pol ,，)，分别参与DNA复制、修复以及DNA损伤后诱发突变形成等过程，与DNA复制保真度直接相关。其表达水平可以被某些烷化剂、射线所诱导，在某些肿瘤细胞中也发现有所改变6，7

18、。我们曾通过定量RT-PCR方法对0.2 mol/L MNNG处理后的HeLa细胞中DNA pol ，及 mRNA水平进行了动态观察，均未见明显改变。目前对pol研究尚未透彻，由于缺少35核酸外切酶校读活性，pol在体外DNA聚合反应中有很高的单碱基错误掺入率(1/1000-1/6600)，为复制保真度最低的DNA聚合酶。它可以通过碱基切除修复途径参与烷化剂、射线造成的DNA损伤修复。同时，pol 具有很强的跨损伤易误性DNA修复功能，在体外能够跨过AP位点或d(GpG)-顺铂加合物等DNA损伤，造成碱基缺失或替换突变6，7。最近发现，pol能跨06-mG损伤(MNNG造成的主要DNA损伤类型

19、)，在新链相应位置上插入一d(A)，认为是烷化剂损伤后造成细胞GA突变的重要原因10。考虑到pol的特性，尤其是复制的低保真度，本实验中MNNG处理后细胞中pol表达水平的上升，是否与MNNG诱发细胞DNA复制保真度下降及遗传不稳定发生有关，我们拟通过反义RNA技术阻断细胞中pol基因的表达，观察细胞非定标性突变率是否有明显改变，进一步研究在进行之中。* 国家自然科学基金(No.39870684)、浙江省自然科学基金(No.397454)资助作者单位：浙江医科大学病理生理教研室及分子生物学实验室(杭州310031)参考文献1Murnane JP. Role of induced genetic

20、 instability in the mutagenic effects of chemicals and radiation. Mutat Res, 1996, 367:11.2Zhang X, Yu Y, Chen X. Evidece for nontargeted mutagenesis in a monkey kidney cell line and analysis of its sequence spectificity using a shuttle-vector plasmid. Mutat Res, 1994, 323:105.3冯朝晖，余应年，张小山，等.MNNG诱发的遗传不稳定vero细胞中DNA体外复制保真度的研究.中国药理学与毒理学杂志，1998，12(2)：144.4胡文蔚，余应年，张小山，等.N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍引起Vero细胞基因表达改变及有关cDNA片段的初步鉴定.中国药理学与毒理学杂志，1998，12：62.5孙雪敏，余应年，张小山，等.转录和翻译抑制对哺乳类细胞非定标性突变形成的影响.癌变.畸变.突变，1996，8：286.6Budd ME, Campbell JL. The roles of the eukaryotic DNA p