竹叶中黄酮提取纯化工艺研究

1、收稿日期2005206229基金项目国家高技术研究发展计划项目(2004AA2Z3782;国家自然科学基金资助项目(30472169;国家中医药管理局项目(04-05ZP21;吉林省中医药管理局项目(2004-114;吉林省科技发展计划重大项目(20020502.作者简介李瑶(1982-,女,硕士研究生;孟祥颖(1962-,女,博士,教授,主要从事中药开发研究;李玉新(1960-,男,博士,教授,博士研究生导师,主要从事基因工程药物、中药开发研究.文章编号100021832(20060120091204竹叶中黄酮提取纯化工艺研究李瑶,齐晓丽,孟祥颖,鲍永利,乌垠,周毓麟,李玉新(东北师范大学遗

2、传与细胞研究所,吉林长春130024摘要采用正交试验的方法对竹叶中黄酮的乙醇提取条件进行了系统研究,同时采用大孔吸附树脂吸附法对纯化条件进行了研究.结果表明:以30倍体积80%的乙醇水溶液在80水浴中浸提3h 为最佳,4种大孔吸附树脂中AB -8树脂为纯化的最适树脂.关键词竹叶;黄酮;正交设计;大孔吸附树脂中图分类号R 28412学科代码3604010文献标识码A竹叶又称淡竹叶,为禾本科植物淡竹(Phyl 2lostachys nigra (Lodd.Munro var.henonis (Mitf .Stapf ex Rendle 的叶.竹叶在我国有很悠久的食用和药用历史.最新的研究结果表明,

3、竹叶中含有大量的黄酮类化合物和具有生物活性的多糖等有效成分,另外竹叶中酚酸类化合物、蒽醌类化合物、萜类内酯和生物碱等都有较强的抑菌杀菌作用,具有很高的应用价值.大量研究表明,黄酮类化合物有类SOD (超氧化物歧化酶和CSH 2Px (谷胱甘肽过氧化物酶的作用,既有清除人体内活性氧自由基,防止生物膜脂质被超氧自由基和羟基自由基氧化的功能,也有类似于维生素E 的作用.因此,许多黄酮及其甙类化合物有抗癌、抗衰老,防止血管硬化,改善心血管系统、脑组织营养、脑神经系统,预防老年痴呆症等多种生理功能和药理作用1.竹叶黄酮能够显著降低血甘油三酯(TG 含量,提高高密度脂蛋白胆固醇(HDL 2c 含量,防止低

4、密度脂蛋白胆固醇(LDL 2c 的氧化,扩张冠脉流量,改善心肌缺血,抑制血小板凝剂和改善血液流变性,并具有良好的钙拮抗作用,显示出优良的防治心脑血管疾病的功效.此外,竹叶黄酮制剂以C -糖苷黄酮为主,具有结构稳定、亲水性强、能深入病灶部位等特点,工艺品质优良,适宜于多种药物剂型的开发.本文对竹叶中的有效成分黄酮的提取纯化工艺进行了研究,找出了最优的提取及纯化条件,为竹叶黄酮工业化生产工艺的建立提供了实验依据2.1实验部分111仪器、试剂及材料仪器:Beckman DU -640分光光度计(上海光谱有限公司,超声波发生器(昆山市超声仪有限公司,恒温水浴锅及冷凝回流装置(北京市医疗设备厂意成公司,

5、旋转蒸发器(上海申科机械研究所.试剂:芦丁标准品购于中国药品检验所.无水第38卷第1期东北师大学报(自然科学版Vol.38No.12006年3月Journal of Northeast Normal University (Natural Science Edition March 2006乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠,分析纯,购自北京化工厂.薄层硅胶层析板G购自青岛海洋化工厂.AB-8,N KA-12,X-5,D-4020购自南开大学化工厂.材料:竹叶采自中国江西,经鉴定为Phyl2 lostachys nigra(Lodd.Munro var.henonis (Mitf.Stapf e

6、x Rendle的竹叶.112标准曲线的绘制标准液的制备:准确称取芦丁标准品2.5 mg,用30%乙醇溶解,定容至25mL.标准曲线的绘制:准确吸取标准液0.2,0.5, 1.0,1.5,2.0,3.0mL分别置于10mL容量瓶中,加5%NaNO2溶液0.3mL摇匀,放置6min 加10%Al(NO33溶液0.3mL摇匀,放置6min 加4%NaOH溶液4mL,再用30%乙醇定容并摇匀,放置10min置比色皿中在波长400600nm 之间测定吸收光谱,确定最大吸收波长为510 nm,在510nm条件下测定吸光度3.113乙醇浓度与竹叶黄酮提取效率相关性的考察温提:用20倍原料重的30%,40%

7、,50%, 60%,70%,80%,95%的乙醇分别在70水浴中提取3h.超声波提取:用20倍原料重的30%, 40%,50%,60%,70%,80%,95%的乙醇在40 kHz的超声波下分别提取30min.提取液定容至100mL,过滤后取滤液0.5mL置于10mL容量瓶中,按标准曲线制作项操作,置比色皿中在波长400600nm之间测定吸收谱,确定最大吸收波长为510nm,在510nm条件下测定吸光度.按下列公式计算出浸提样中总黄酮的含量(mg/g:浸提样中总黄酮含量=2CV/W.式中C为从回归方程中求得的芦丁量(mg,V为定容体积(mL,W为样品质量(g.114竹叶黄酮乙醇提取条件的正交实验

8、设计为系统考察乙醇提取法的工艺参数,根据已有的资料及单因素乙醇质量分数的实验结果,选用乙醇质量分数、提取温度、提取时间和乙醇用量作为考察因素,以测得的浸提样品中总黄酮含量为考察指标,选用L9(34正交表实验(见表1.表1竹叶黄酮乙醇提取条件正交实验因素水平水平因素浸提温度(A/乙醇的质量分数(B/%浸提时间(C/h乙醇用量(D16040210倍27060320倍38080430倍将粉碎的竹叶准确称重后,按表1的条件进行浸提.提取液定容至100mL,过滤后,分别取滤液0.5mL置于10mL容量瓶中,按标准曲线制作项操作,置比色皿中在510nm条件下测定吸光度,按上述公式计算总黄酮含量.115竹叶

9、黄酮的分离纯化大孔吸附树脂筛选本实验选择了对黄酮均有一定吸附能力的4种树脂,分别是AB-8,N KA-12,X-5,D-4020,比较了它们对竹叶黄酮的吸附、解吸附特性,以筛选出纯化竹叶黄酮的最适树脂.11511树脂对竹叶黄酮吸附率的测定准确称取经预处理的干树脂2.0g装入具塞的磨口三角瓶中,去离子水充分吸胀后,加入澄清的竹叶黄酮水溶液100mL并置电动摇床上振荡12h,过滤,测定滤液中剩余黄酮的质量,按下式计算各树脂室温下的吸附量:Q=(C0-C VV/W.式中Q为吸附量(mg/g;C0为初始浓度(mg/ mL;C V为剩余浓度(mg/mL;V为溶液体积(mL;W为树脂质量(g4.11512

10、树脂的解吸附率测定取按照115.1的方法吸附饱和的树脂,加入70%的乙醇150mL,浸泡振摇12h,过滤,测定滤液中黄酮的质量,根据黄酮解吸量计算解吸率(%.按下式计算各树脂室温下的解吸量: P=CV/W.式中P为解吸量(mg/g,C为解吸后的质量浓度(mg/mL,V为溶液体积(mL, W为树脂质量(g.11513AB-8大孔吸附树脂对竹叶黄酮的纯化竹叶的醇提取液减压蒸干后,用水溶解,过滤,将水溶液上AB-8大孔吸附树脂柱根据黄酮类化合物的性质水洗以除去水溶性杂质,20%乙醇洗脱水溶性杂质,50%乙醇洗脱黄酮.50%乙醇洗液减压蒸干,真空干燥至恒重.精密称量2.1 mg,定容至100mL,从中

11、取0.5mL于10mL容量瓶中,同标准曲线法操作,于490nm条件下测量吸光度,以求出经AB-8纯化的黄酮纯度.2结果与讨论211标准曲线的绘制以标准芦丁量C为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程为A=2.59C-0.0162,相关系数r=0.9995.29东北师大学报(自然科学版第38卷 212乙醇质量分数与竹叶黄酮提取效率相关性的考察超声和温浸各有不同的最佳提取乙醇质量分数.在超声条件下,虽然乙醇质量分数为95%时提取效率达到最高,但是与乙醇质量分数为40%时差异不大,从节省原料方面考虑,认为乙醇质量分数为40%是超声的最适提取浓度.而温浸在高质量分数醇溶液的提取率较高,质量

12、分数在70%以上提取率基本恒定.超声和温浸两组间提取率无显著差异(见图1.考虑到超声不适合于大量生产,故应选用温浸6.213 正交实验结果图1乙醇的质量分数与竹叶黄酮提取效率的相关性从表2的直观分析及表3的方差分析可知,4种因素对浸提结果影响大小依次为B >A >D >C.B ,A 对浸提样品中总黄酮的含量有极显著影响,而C ,D 的作用不明显.4种因素的最佳组合为A 3B 3C 2D 3,即用30倍原料重的80%乙醇溶液,在80浸提3h ,总黄酮浸出率最高7.表2竹叶黄酮乙醇提取条件正交实验结果设计A B C D列号1234总黄酮含量/(mg/g 小计111113.763.

13、567.3221222 4.46 4.328.7831333 5.07 5.0210.0942123 4.51 4.278.7852231 4.38 4.328.762312 5.44 5.2510.6973132 4.49 4.468.9583213 5.20 4.9310.1393321 6.02 5.1411.16T 126.1925.0528.1427.1843.3341.2784.60T 228.1727.6128.7228.42T 330.2431.9427.7429.00214不同大孔吸附树脂对竹叶黄酮的吸附特性4种树脂对竹叶黄酮都有比较好的吸附和解吸附特性,其中AB -8的吸附

14、率为65.2%,其解吸附率为60%,两项指标均为最高值,故筛选出AB -8作为竹叶黄酮的纯化树脂(见表4.经AB -8大孔吸附树脂的纯化,竹叶黄酮纯度可达到31.2%8.表3竹叶黄酮乙醇提取条件正交实验方差分析方差来源自由度偏差平方和均差平方F 值显著性A 21.370.68512.2333B 2 4.04 2.0236.0733C 20.080.040.71D20.290.145 2.59误差e90.50.05633为差异极显著,3为差异显著,F 0.05(2,9=4.26,F 0.01(2,9=8.02.表4不同大孔吸附树脂对竹叶黄酮的吸附特性树脂类型吸附试验比色参数吸附量/(mg/g 吸

15、附率/%解吸试验比色参数解吸量/(mg/g 解吸率/%X -50.172931763.50.151624351AB -80.163832665.20.186329360N KA -120.1934297.559.60.164326158D -40200.3202175350.0850146.2555.739第1期李瑶,等:竹叶中黄酮提取纯化工艺研究3结论提纯的有效方法之一是利用大孔吸附树脂纯化样品.大孔吸附树脂是近十年发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂,它具有物理化学稳定性高、吸附选择性独特,不受无机物存在的影响,再生简单、解析条件温和、使用周期长、易于构成闭路循环、节省费用等诸多特点,广泛

16、用于中药生化物质成分的分离纯化.其原理是:任何固体内部的分子,在其周围受到的作用力是相等的,而固体表面上分子受到的作用力是不均等的,故在其表面遇到与其电荷相反的物质,即发生吸附作用.而大孔吸附树脂的吸附作用主要是通过表面吸附、表面电性或形成氢键等来实现的.单因素乙醇质量分数的考察,使我们详细了解了乙醇质量分数对竹叶黄酮提取率的影响,从而为正交实验的乙醇质量分数水平设计奠定了实验基础,同时确定温浸为提取条件.正交实验的结果表明,乙醇质量分数的影响最大,提取温度次之,故得出30倍80%乙醇在80下提取3h为最佳提取条件.AB-8以其较高的吸附率和解吸率而被筛选出作为纯化竹叶黄酮的最适树脂.此项研究

17、为竹叶黄酮的提取工艺提供了重要的参考.参考文献1黄文,王益.竹叶的化学成分及应用进展J.中国林副特产,2002,8(3:65.2孟阳,于丽娟,洪伯铿1竹叶J.食品科学,1997(18:12-2713冯涛,曹东旭,吕晓玲.竹叶总黄酮的测定J.中国食品添加剂,2002,6:85-88.4麻秀萍,蒋朝晖,杨玉琴.大孔树脂对银杏叶黄酮的吸附研究J.中国中药杂志,1997,22(9:539-542.5杨洋,陈朝勇,韦小英,等.竹叶黄酮的提取和纯化工艺研究J.江西食品工业,2004(2:32-35.6许刚1竹叶中黄酮提取方法的研究J.分析化学研究学报,2000(14:857-85917陈冲,罗思奇1银杏叶

18、提取物生产工艺的研究J.中草药,1997(28:402-40418潘冗,陈强,谢慧明,等1大孔树脂对葛根黄酮的吸附分离特性研究J.农业工程学报,1999(15:55-581Extraction and purif ication technique of flavones from bamboo leavesL I Yao,Q I Xiao2li,M EN G Xiang2ying,BAO Y ong2li,WU Y in,ZHOU Yu2lin,L I Yu2xin(Institute of G enetics and Cytology,Northeast Normal Universit y,Changchun130024,ChinaAbstract:Optimal conditions for the extraction of flavones from bamboo leaves were systemically research