缺血后处理对肾缺血再灌注损伤大鼠肾组织细胞凋亡及Bc

1、缺血后处理对肾缺血再灌注损伤大鼠肾组织细胞凋亡及Bcl-2和Bax基因表达的影响刘晶晶1，赵砚丽1，（河北省人民医院麻醉科，河北，石家庄，050051）Effect of ischemic postconditiong on apoptosis and the expression of Bcl-2 and Bax gene in renal tissue induced by ischemia-referfusion injury in ratsLIU Jing-jing, ZHAO Yan-li, Department of Anesthesiology, Peoples Hospital

2、 of Hebei Province,Shijiazhuang 050051, ChinaAbstract AIM To investigate the effect of ischemic postconditiong on apoptosis and the expression of Bcl-2 and Bax gene in renal tissue after transient ischemia-reperfusion (I/R) injury and its mechanism. METHODS Eighteen male SD rats weighing 250-280g we

3、re randomly allocated into 3 groups (n=6 each): group sham operation (S); group I/R and group I/R+ischemic postconditioning(IPo). The rats were anesthetized with intraperitoneal chloral hydrate 300 mg·kg-1. Bilateral kidneys were exposed through midline incision and bilateral renal pedicels wer

4、e occluded 45 min with atraumatic mini-clamp then unclamped for 6 h. In S group the kidneys were exposed but their pedicles were not clamped. In IPo group, 45 min ischemia was followed by three 10 s episodes of ischemia at 10 s intervals for reperfusion. The animals were killed at 6 h of reperfusion

5、. Blood samples were taken from heart for determination of urea nitrogen(BUN) and serum creatinine(Cr) uric acid(UA) concentrations. Kidneys were removed immediately for determination the expression of Bcl-2 mRNA and Bax mRNA by RT-PCR and for microscopic examination. The apoptosis in the nephridial

6、 tissue was assessed using TUNEL and apoptotic index(AI) was calculated. RESULTS The Cr and BUN concentrations, the expression of Bax mRNA and the AI were significantly increased whereas the expression of Bcl-2 mRNA and the Bcl-2 mRNA/Bax mRNA ratio were significantly decreased in I/R group as compa

7、red with S group（P< 0.05）. Microscopic examination showed edema, degeneration and necrosis of ischemia renal tubule endothelial cell, tubular ectasia, congestion, edema and neutrophil of interstitial substance in I/R group The BUN and serum Cr levels, the expression of Bax mRNA and the apoptotic

8、index(AI) were significantly lower whereas the expression of Bcl-2 mRNA and the Bcl-2 mRNA/Bax mRNA ratio were significantly higer in IPo group than in I/R group（P< 0.05）. CONCLUSION Key words Ischemic；Kindey；Reperfusion injury； Apoptosis；Genes，Bcl-2 摘要 目的：观察缺血后处理 (ischemic postconditioning , IPo

9、)对大鼠肾缺血再灌注(ischemia - reperfusion , I/ R)损伤后肾组织细胞凋亡及Bcl-2和Bax基因表达的影响，并探讨其肾保护的机制。方法： 18只雄性SD大鼠随机分为3组（n6），假手术组（S组），缺血再灌注组（I/R组），缺血后处理组（IPo组）。采用夹闭双侧肾蒂45 min、再灌注6 h制备肾脏缺血再灌注模型。IPo组在夹闭双侧肾蒂45 min后，再灌注10 s，缺血10 s，反复3次，再全面恢复血液灌注。再灌注6 h时处死大鼠， 酶法测定血清肌酐（Cr）含量、苦味酸不除蛋白法测定尿素氮（BUN）含量，采用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法检测肾组织Bcl-2

10、 mRNA和Bax mRNA表达，表达水平以与其相应的内参actin的光密度比表示；原位末端脱氧核苷酸转移酶标记（TUNEL）法检测肾组织中凋亡细胞，计算凋亡指数（apopatic index，AI）；苏木素-伊红（HE） 染色，在光镜下观察肾组织病理学变化。结果：与S组比较，I/R组肾组织Cr 和BUN浓度升高（P <0.05），Bcl-2 mRNA表达量降低（P <0.05），Bax mRNA表达量升高（P <0.05），Bcl-2 mRNA/Bax mRNA的比值降低（P <0.05），凋亡指数（AI）增加（P <0.05），组织形态学观察可见肾小管上皮细胞

11、水肿，变性坏死，肾小管扩张，间质淤血、水肿、大量中性粒细胞浸润。与I/R组相比， IPo组肾组织Cr 和BUN浓度降低（P <0.05），Bcl-2 mRNA表达量升高（P <0.05），Bax mRNA表达量降低（P <0.05），Bcl-2 mRNA/Bax mRNA的比值升高（P <0.05），凋亡指数（AI）减少（P <0.05），肾组织形态学损伤减轻。结论：缺血后处理可减轻肾脏I/R损伤，其肾保护作用可能与其上调Bcl-2 基因和下调Bax基因的表达，使Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比值升高，从而抑制缺血再灌注损伤后的肾组织细胞凋亡有关。关键词缺

12、血；肾；再灌注损伤；细胞凋亡；基因，Bcl-2中图号查阅中图图书馆分类号第四版式 文献标识码A0 引言缺血后处理可以减轻心肌缺血再灌注损伤1，2，在随后的实验中发现，IPo还可以减轻脑3、肝4及肠的缺血再灌注损伤。本课题的前期研究发现IPo可以抑制肾I/R损伤诱发的肾组织细胞凋亡，具有一定的肾保护作用，但是抑制凋亡的的具体机制有待探讨。细胞凋亡是基因控制的细胞主动死亡过程。目前认为至少有两类基因与凋亡调控有关，以Bcl-2为代表的抗凋亡基因和以Bax为代表的促凋亡基因共同调节细胞凋亡。本研究观察IPo对大鼠肾I/R损伤后肾组织细胞凋亡及Bcl-2和Bax基因表达的影响，并探讨IPo肾保护的机制

13、1 材料和方法1.1 动物选择及分组 健康雄性SD大鼠18只，体重250280 g ，由河北省实验动物中心提供，随机分为3组：假手术组（S组），缺血再灌注组（I/R组），缺血后处理组（IPo组），每组6只。1.2 模型制备 术前禁食12 h，自由饮水。大鼠腹腔注射10水合氯醛3 ml/kg麻醉后，将大鼠仰卧位四肢固定于鼠台上，行腹正中切口，钝性分离肾包膜，显露和游离肾脏，仔细分离肾蒂，保护输尿管，用无损伤动脉夹夹闭双侧肾蒂，肾脏颜色变为暗红色即可确认肾脏血流阻断，造成双侧肾缺血45 min后，显露肾脏，松开动脉夹,肾脏由暗红色恢复鲜红色即可确认血流恢复，逐层缝合腹部正中切口。再灌注6 h即为肾

14、缺血再灌注模型。夹闭和放开肾蒂时腹腔内各注射林格液20 ml/ kg 。S组仅行开腹，游离出双侧肾脏，分离双侧肾蒂不夹闭，伤口用生理盐水纱布覆盖，暴露45 min不作肾缺血处理； IPo组夹闭双侧肾蒂45 min后，再灌注10 s，缺血10 s，反复3次，再全面恢复血液灌注6 h。1.3 标本制备 再灌注后6 h时,过量麻醉剂下经心脏抽血迅速处死动物。将血液标本注入离心管，静置30 min，2500 r/ min 离心15 min ,提取血清标本，70冰箱保存，待测。在无菌条件下，迅速摘取左肾，分装入1.5 ml离心管，液氮冻存，用于进行PT-PCR。取右肾，4多聚甲醛固定，后依次进行脱水、透

15、明、浸蜡，制备石蜡切片，4保存待用。1.4 血清Cr、BUN含量的测定 应用Selectra-E全自动生化分析仪（Vital，荷兰）酶法测定血清Cr水平，苦味酸不除蛋白法测定BUN含量。1.5 肾组织Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达的测定 取50100 mg标本匀浆后，Trizol试剂提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，紫外分光光度计检测法测定RNA含量，取等量RNA逆转录合成cDNA，以-actin为内参照，扩增Bcl-2、Bax和-actin，所有引物均由上海生物工程公司合成。引物序列和扩增产物长度，见表1。Bcl-2基因扩增条件为：变性94（5 min），然后扩增94

16、（45 s），52（30 s），72（45 s）（35个循环），延伸72（5 min）。Bax基因扩增条件为：变性94（5 min），然后扩增94（45 s），56（45 s），72（45 s）（35个循环），延伸72（5 min）。取RT-PCR产物4l，加上样缓冲液1l，在1.5琼脂糖凝胶上电泳，用UVP凝胶图像成像系统（美国UVP 公司）拍摄打印实验结果，用凝胶图像分析系统（Gel-Pro Analyzer Version 3.0）进行光密度测量，以每一目的基因与其相应的内参actin的比值代表该样品PCR产物的相对含量。1.6 肾组织病理学观察和凋亡细胞的检测 HE染色，在400倍光镜

17、下观察肾组织病理学改变。TUNEL法测定检测肾组织中凋亡细胞（试剂盒购自德国Boehringer Mannhiem公司）按试剂盒说明书操作。光镜下观察凋亡细胞，细胞核呈棕黄色者为阳性细胞,于凋亡细胞分布区域，随机选取5个视野, 用10×40 倍光镜计数凋亡细胞，以肾小管上皮凋亡阳性细胞数占总肾小管细胞数的百分比作为肾小管细胞凋亡指数（apopatic index，AI），AI ()= 阳性细胞数/视野所有细胞总数×100。统计学处理 采用SPSS 11.5软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，计量资料组间比较采用单因素方差分析, P&l

18、t;0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 各组Cr 、BUN水平的变化 再灌注6 h时，与S组相比， I/R组和IPo组Cr 、BUN水平均明显升高（P <0.05），与I/R组比较，再灌注6 h时，IPo组Cr 、BUN浓度降低（P <0.05），见表2。 2.2 Bcl-2 mRNA、Bax mRNA及其比值的变化 PCR所得的Bcl-2 、Bax和-actin条带的大小与设计的一致（扩增目的片段长度Bcl-2 为702bp，Bax为407bp，-actin为375bp）。大鼠肾组织总RNA行PCR扩增的产物电泳条带，Bcl-2 mRNA：S组电泳条带最明显， IPo组的

19、电泳条带比较明亮，I/R组电泳条带较浅，见图1。Bax mRNA：S组电泳条带浅暗，其次为IPo组的电泳条带比较明亮，I/R组最明显，见图2。与S组相比，I/R组和IPo组Bcl-2 mRNA表达量降低，Bax mRNA表达量升高，Bcl-2 mRNA/Bax mRNA的比值降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与I/R组比较，IPo组Bcl-2 mRNA表达量升高，Bax mRNA表达量降低，Bcl-2 mRNA/Bax mRNA的比值升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。2.3 组织病理学结果 S组肾小球、肾小管未发现明显的形态学改变,见图3；I/R组部分肾小管上皮

20、细胞肿胀，出现水样变性和空泡变性，肾小管扩张，内可见管型和坏死脱落细胞，少量肾小管腔内有蛋白性液体积聚，间质充血水肿大量炎细胞浸润，管周血管明显扩张淤血,见图4； IPo组肾小球轻度淤血,少量肾小管上皮细胞轻度水肿、空泡变性，罕见管型，间质充血水肿有少量炎细胞浸润管周稍有淤血，见图5。2.4 肾小管上皮细胞凋亡的变化 S组偶见凋亡细胞，见图6，I/R组和IPo组凋亡细胞数增加，见图7，8。与S组相比，再灌注6 h时，I/R组和IPo组AI明显增高（P<0.05）；但IPo组AI较I/R组下降（P<0.05），见表3。表1 RT-PCR反应检测Bcl-2、Bax和-actin基因表达

21、的引物序列和扩增产物长度基因上游引物下游引物扩增产物（bp）Bcl-25-caagaatgaaagcacatcc -35-atcccagcctccgttatcc -3702Bax5-ggctggcaaggcctggt -35-agccacaaagatggtcactgtct -3407-actin5-gccatgtacgtagccatcca-35-gaaccgctcattgccgatag-3375表2 三组大鼠肾I/R损伤6h时肾功能的比较（n6，±s）组别Cr（mg/L）BUN（mmol/L）S组53±75.4±0.6I/R组110±10*21.2

22、77;2.2*IPo组76±9*# 11.7±1.6*#与S组比较，*P <0.05 与I/R组比较，#P <0.05表3 三组大鼠肾组织Bcl-2 mRNA、Bax mRNA及其比值和凋亡指数的比较（n6，±s）组别Bcl-2 mRNABax mRNABcl-2 mRNA/ Bax mRNAAIS组0.91±0.060.58±0.031.574±0.0302.7±1.3I/R组0.65±0.04*0.74±0.05*0.872±0.051*28.4±5.9*IPo组0.7

23、7±0.05*#0.66±0.04*#1.172±0.025*#18.8±3.8*#与S组比较，*P <0.05 与I/R组比较，#P <0.053 讨论本研究采用夹闭双侧肾蒂45 min再灌注6 h制备肾脏缺血再灌注损伤模型5。I/R组Cr、BUN浓度水平明显升高，提示肾功能严重受损，肾组织形态学损伤严重。本实验所采用的后处理的时间，次数是根据预实验结果和参考文献6,7确定的。TUNEL法是目前常用的分析细胞凋亡的研究手段，故本研究采用此方法探讨肾小管上皮细胞凋亡程度。有研究表明，肾I/R损伤与肾组织细胞凋亡8及其调控基因Bcl-2和Bax

24、的表达密切相关9。Bcl-2可通过抑制自由基的产生及细胞内钙超载，抑制线立体膜的通透性、阻止细胞色素C的释放及caspase的激活等机制发挥抑制凋亡的作用。最近有研究发现Bcl-2蛋白能通过降低氧自由基活性和抑制氧自由基生成发挥抗氧化作用，Bcl-2蛋白还能维持线立体的氧化功能10。而Bax是促凋亡基因，能促进细胞因子缺失而诱导细胞凋亡，Bax与Bax可形成同源二聚体，两者的比例决定细胞向存活还是凋亡方向发展促进细胞凋亡。本研究证明IPo可能通过上调肾小管上皮细胞Bcl-2和下调Bax，从而使Bcl-2/ Bax比值升高来发挥其抗氧化、增加膜稳定性作用。本实验结果显示，双侧肾缺血45 min后

25、，采用再灌注10s，缺血10s，反复3次的间断恢复肾血流灌注的IPo方法，可以改善肾功能，减轻病理学改变，降低凋亡指数，提示缺血后处理可以保护肾脏，减轻缺血再灌注损伤。本实验所采用缺血再灌注前、反复短暂的预再灌注、停灌注的IPo 方案，在某种意义上相当于有控制的缓慢间歇性复氧，可减少突然复氧时氧自由基的爆发性产生，并刺激胞内抗氧化酶和自由基清除剂的释放而发挥保护效应。IPo发生在缺血后、再灌注前，面对的是已缺氧肾小管上皮细胞, 是从建立一种更合理、更有效的再灌注角度出发, “处理”和挽救已缺血肾小管上皮细胞，最大限度地减轻再灌注损伤。而且IPo是在器官缺血后、恢复全面血流灌注前施之，方法简单、

26、时间从容，因此可能更有直接的临床实用价值11。综上所述，IPo可减轻肾脏I/R损伤，其肾保护作用可能与其上调Bcl-2 基因和下调Bax基因的表达，使Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比值升高，从而抑制缺血再灌注损伤后的肾组织细胞凋亡有关。参考文献：1 Sato H, Jordan JE, Zhao ZQ, et al. Gradual reperfusion reduces infarct size and endothelial injury but augments neutrophil accumulation. Ann Thorac SurgJ, 1997, 64: 109911

27、07.2 陶凌, 李源, 高峰, 等. 缺血后处理对急性心肌缺血再灌注兔心脏的保护作用. 第四军医大学学报J，2000, 21: 116118.3 熊利泽, 杨静, 徐宁, 等. 缺血后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响. 中华麻醉学杂志J, 2005, 25: 508-510.4 孙凯, 刘志苏, 孙权. 缺血后处理对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用. 武汉大学学报(医学版) J, 2004, 25: 104-107.5 陈聪聪, 柳子明, 王慧华, 等. 乌司他丁对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用. 中华麻醉学杂志J, 2004, 24: 828-832.6 Kin H, Zhao ZQ, Sun HY, et al. Postconditioning attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury by inhibiting events in the early minutes of reperfusion. Cardiovasc ResJ, 2004, 62: 74-85.7 Heusch G,