美托洛尔对豚鼠乳头肌细胞缺氧再灌注后跨膜电活动的影

1、美托洛尔对豚鼠乳头肌细胞缺氧再灌注后跨膜电活动的影响吴文浩 路红梅 河北医科大学第二医院麻醉科心肌缺血-再灌注可使心肌细胞动作电位发生改变，如动作电位时程（APD）、有效不应期（ERP）的缩短，振幅（APA）的降低，静息电位（RMP）的升高，动作电位0相最大除极速率（Vmax）的下降等，并因此可能导致严重的甚至致死性的室性心律失常发生1。心肌缺血再灌注心律失常发生机制已经成为目前重要的研究课题。已有研究表明，折返、自律性增强及触发活动2，3在缺氧-再灌注过程中扮演重要的角色。导致折返、自律性增强及触发活动的因素主要是在缺氧过程中代谢的改变以及再灌注过程中氧自由基1 、NO、1，4，5三磷酸肌醇

2、（1NS(1,4,5)P3）所导致的再灌注损伤5和细胞内的Ca2+超负荷。自六十年代应用-受体阻滞剂以来，其在临床上已经得到广泛应用。选择性1-受体阻滞剂美托洛尔，选择性作用于1-受体，减少和避免了非选择性-受体阻滞剂呼吸系统的副作用。美托洛尔已被广泛用于高血压、心绞痛、心律失常、充血性心力衰竭的治疗，在降低冠心病和脑卒中的发病法致死率，心肌梗塞的预防和治疗中发挥了一定作用。在心肌缺血再灌注过程中，美托洛尔对缺氧/再灌注心肌细胞动作电位有何影响，目前尚未定论，本实验采用传统的标准微电极技术，在模拟缺氧/再灌注状态下，本研究的目的在于探讨美托洛尔抗缺氧/再灌注心律失常（RIA）的作用及对豚鼠乳头

3、肌细胞动作电位的影响，研究其在缺氧/再灌注过程中的应用价值。材料与方法一 试验仪器1. 德国HSE-309微电极放大器，放大倍数10倍。2. 日本KIKUSU I DSS6521示波器。3. 上海国泰电讯器材厂BC-1步进电机微操纵器。4. 采样卡，12BITS，转换时间25ns5. 计算机，PENTIUM133,32M内存，数据记录系统基于WINDOWS，采样率为12kHZ，最大连续记录数据量10M。6. 德国HSE PULLER-819玻璃微电极拉制器7. 苏州产CFP-4多功能心脏脉冲程控刺激仪8. 实验浴槽，恒温水浴及灌流设备。9. 显微镜二、实验材料1. 有氧台氏液9： NaCL 1

4、37.0 mM,KCL 5.4mM, NaH2PO40.42mM NaHCO3 11.9mM, CaCL2 1.8 mM MgCL2 1.05 mM Glucose 5.5 mM2. 无氧台氏液10： NaCL 123.0 mM, KCL 10.0mM, NaH2PO4 0.9mM NaHCO3 6.0mM, CaCL2 2.5mM MgSO4 0.5 mM Sodium Lactate 20.0 mM3. 以3MKCL充灌的玻璃电极毛坯，直径1.2mm4. 美托洛尔：广州市医药工业研究所实验车间，批号：00008802三、实验方法 随机选择健康成年豚鼠25只，体重220300g，雌雄不拘。用

5、木棒击豚鼠头部致昏，迅速开胸取出心脏，用充以混合气（含O295%、CO2 5%）、pH值为7.40的台氏液冲净残余血液后，分离乳头肌标本（长34 mm,宽12 mm）,固定于浴槽内，持续以充混合气，用pH值为7.40的普通台氏液成分（mM）糖5.5、NaCL 137、,KCL 5.4、NaH2PO4 0.42、NaHCO3 11.9、CaCL2 1.8 、MgCL2 1.05灌流，灌流速率为3 ml/min, 浴槽内台氏液温度控制在370.5，同时用1 500 ms的起搏周期、2倍舒张期阈值的电压、脉宽2 ms的电刺激连续起搏豚鼠乳头肌。用已经清洁的微电极末毛坯现场拉制玻璃电极，并充满3M K

6、CL，将玻璃微电极固定于步进器并连接纪录电极，将参考电极固定于浴槽内台氏液中，利用步进器将玻璃微电极插入乳头肌细胞，引出跨膜动作电位，信号经微电极放大器放大10倍后输出在示波器上显示，同时输出信号经采样卡引入计算机记录系统以备随时记录。 随机选取豚鼠乳头肌标本7份，引出正常稳定的动作电位，然后分别进行对照组及给药组实验。1. 观察美托洛尔对豚鼠乳头肌正常情况下电生理特性的影响标本在正常台氏液灌流30min ，记录基础起搏周期（S1S2）为500ms 的用药前及用药后30 min 时的各种电生理参数，ERP 按文献方法测定10（见图3）2. 美托洛尔对乳头肌细胞再灌注性心律失常的影响3. 观察美

7、托洛尔对缺氧/再灌注状态下乳头肌电生理特性的影响将标本分为模型对照组和给药组。模型对照组标本在正常台氏液灌流槽中平衡60min后，用缺氧台氏液灌流10min 然后再用正常台氏液灌流30min . 给药组标本依次用正常台氏液和含有一定浓度的药物的正常台氏液溶液平衡灌流30min， 然后用含有相同浓度药物的缺氧和正常台氏液与模型对照组平行操作。灌流液中药物浓度分别为美托洛尔0.05g/ml、0.1g/ml12，观察在缺氧再灌注过程中心律失常发生率，并测定缺氧前及缺氧后2、5、7、10min，再灌注2、5、7、10、12、15、20、25、30min 时的电生理参数。动作电位观察指标包括：RMP、E

8、RP 、APA、复极90%的动作电位时程（APD90），复极50%的动作电位时程（APD50），复极30%的动作电位时程（APD30），Vmax及ERP/ APD90四、统计学处理 计量资料以均数标准差表示，药物对正常灌流标本的影响用配对t检验，计数资料的比较采用卡方检验， P0.05为差异用统计学意义。 五、结果1 美托洛尔对豚鼠乳头肌正常心肌动作电位的影响： 表1 显示，0.05g/ml及0.1g/ml的美托洛尔对豚鼠乳头肌APD、RMP、APA、ERP均无显著性差异（P0.05）。 表1 美托洛尔对豚鼠乳头肌正常心肌电生理特性的影响 N RMP（mv） APA（mv） PAD30(ms)

9、 APD50(ms) APD90(ms) ERP(ms) 给药前 18 -89.12.4 121.510.9 112.715.6 135.612.8 170.817.2 162.3140.05g/ml 8 -88.61.7 119.715.4 108.211.4 130.520.1 167.912.7 158.7170.1g/ml 10 -86.71.6 116.313.0 114.813.5 137.710.2 179.511.7 165.2122. 缺氧再灌注状态下豚鼠乳头肌动作电位参数的变化 随着缺氧时间的推移，APD30、APD50、APD90、ERP、APA、Vmax、及ERP/ A

10、PD90逐渐缩短，RMP逐渐升高。缺氧液灌流10min时，APD30、APD50、，APD90、ERP均分别较缺氧前明显缩短41%、37.3%、32.3%和34.3%（P0.01），APA和Vmax逐渐减低，均分别较缺氧前减低38.0%和42.8%（P0.01），RMP逐渐升高，分别较缺氧前升高29.8%（P0.01）；ERP/ APD90则由缺氧前的0.920.09降低至0.820.14， 但与缺氧前比较，无统计学意义。 再灌注2min 后，各个乳头肌细胞动作电位参数开始恢复正常，大约至再灌注20min时恢复至缺氧前水平。再灌注2min时，APD30、APD50、APD90及ERP仍较缺氧前

11、分别明显缩短37.1%、34.1%、31.2%和30.2%（P0.01）；APA和Vmax也随再灌注时间恢复，但至再灌注2min时仍较缺氧前明显减小32.9%和38.4%（P0.01），；RMP比缺氧前明显升高25.8%（P0.05）,但与缺氧前比较，未表现出显著性差异（P0.05）。3.美托洛尔对乳头肌细胞再灌注性心律失常的影响模型对照组（n=10）中，有1例在缺氧过程中发生了室早，2例在再灌注过程中发生了延迟后除极。无论在低浓度还是在高浓度美托洛尔组，均未发现RIA的发生。 4.美托洛尔对缺氧再灌注下豚鼠乳头肌细胞动作电位参数的影响 低浓度的美托洛尔（0.05g/ml）组，缺氧液灌流10m

12、in 时，APD30、APD50、APD90及ERP分别短于对照组14.1%、11.2%、4.1%和3%，未达到统计学意义（P 0.05）；对APA、RMP及Vmax无显著性影响（P 0.05）；ERP/APD90较对照组明显增高34.1%（P0.05）。再灌注2min 后，APD30、APD50、APD90及ERP分别较对照组缩短 25.7%、24%、14.5%和7.9%，其中APD30和APD50的缩短具有统计学意义（P 0.05）；ERP/APD90较对照组增高27.1 %（P0.05）。 高浓度的美托洛尔（0. 1g/ml）组，缺氧台氏液灌流10min时，APD30、APD50、APD

13、90及ERP分别长于对照组16.7%、21.7%、30.3%、23.9%，其中APD90及ERP的延长具有统计学意义（P 0.05）；ERP/APD90较对照组增高20.7%，但无显著性差异（P 0.05）。再灌注2min时，APD30、APD50、APD90及ERP分别长于对照组21.3%、24.1%、27.9%、26.6%，其中APD90及ERP的延长具有统计学意义（P 0.05）；ERP/APD90较对照组增高15.3%，但无显著性差异（P 0.05）。讨 论有文献报道，-受体阻滞剂主要作用于L型钙通道电流（ICa-L）、内向整流钾电流（IKi）及瞬间外向钾电流（Ito），作用于这些通道

14、的结果可缩短或延长APD和ERP14。IKi为电压和时间依赖性电流，它也受细胞内钙离子调解，它决定了细胞膜静息电位的水平，若阻断IKi可使细胞膜静息电位上升15，16 。ICa-L是细胞外钙离子进入细胞的主要通道，该电流在膜电位大于-30mv时被激活，但失活的电位在+20mv以上，由此通道进入的钙离子将触发肌浆网释放钙离子，既所谓钙触发钙释放机制，ICa-L与平台的形成和心肌收缩的持久性有关， 抑制ICa-L可使动作电位时程缩短14。Ito是一种在动作电位中的主要外向复极电流，存在于一些哺乳动物的心房和心室肌只能过17，其参与3相平台期和3相的快速复极，抑制Ito可使动作电位时程延长。另外一些

15、-受体阻滞剂尚可抑制内向电流Na通道，如普奈洛尔（propranolol），这种作用被称为膜稳定作用（或奎尼丁样作用）18，其表现在动作电位参数上就使Dv/Dt减小。另外一些-受体阻滞剂尚可抑制外向钾离子IKi，使APD和ERP延长，这类-受体阻滞剂被称为第三类抗心律失常要，如索他洛尔（sotalol）19。文献报道美托洛尔主要为抑制IKi、Ito、ICa。IKi对其最敏感，但由于钳制的膜电压相对于穿膜钾离子点六的平衡点为总为负值，从而对于APD及RMP无影响14。美托洛尔对于Ito有中度抑制作用，其抑制域值为大于1M，小于10M，而对于ICa-L一般剂量都可以抑制14。 心肌缺氧可引起心肌A

16、PD的缩短，APA和Vmax的降低及RMP的升高，而引起这些改变的主要原因为缺氧所引起的心肌代谢的改变，包括（1）对脂肪的分解利用减少；（2）心肌对葡萄糖的利用增加。结果可导致：1）ATP产生减少；2）乳酸增加；3）游离脂肪酸增高；4）酸中毒。很多研究结果提示，pH降低可减弱动作电位2相的缓慢内向电流Isi。Isi有三种成分，它们是Isi1、Isi2、Isi3。Isi1就是快钙电流ICa-f，它融合在0相和1相之中，与2相的关系很小。Isi2、亦称交换性钙电流（ICa，Na）,它由细胞内钠钙激活，ICa-f所形成的细胞内钙离子增高，激活细胞膜的钠钙交换机制，将钠排出细胞，同时钙离子进入细胞内，

17、酸中毒可抑制此交换，使动作电位中钙离子内流减少，机制尚不清楚。Isi3亦称慢钙通道，既L型钙通道，H+对Ca2+通道有直接抑制作用。Isi3的减弱可使动作电位时程缩短。ATP敏感性钾离子电流IK-ATP在缺氧情况下也可产生作用25，IK-ATP是受细胞内ATP调节的电流，细胞内ATP对这种特殊的钾通道有抑制作用。在缺氧状态下，由于ATP的产生减少，激活这种通道， 促进钾离子外流，使复极加速，动作电位时程缩短，不应期缩短，舒张其电位负值减小，成为致心律失常的因素。另外，H+也可增加ATP敏感性钾通道的活性。H+也可对心肌动作电位APA、RMP产生影响。维持静止膜电位电流成分有：（1）内向整流钾电

18、流（IKi），起稳定静止膜电位的作用；（2）钠内向背景电流（INa,b）,它并无电压或时间依赖性，是由于细胞外钠离子浓度高于细胞内，故有内向被动转运，但此时细胞膜对钠离子浓度的通透性很低，故只形成一种弱小而 持续的渗漏电流，它的效果是使膜电位的负值减小一点；（3）生电性钠-钾泵电流（IP），细胞内外钠离子、钾离子的浓度的差别，靠钠钾交换泵维持，它利用ATP的能量，逆着离子的浓度差转运，属于主动转运。交换过程中，把3个钠离子泵出细胞外，把2个钾离子泵入细胞内，因此有生电性，形成外向电流，其效果是使膜电位负值增大一点。细胞内酸中毒可抑制IKi，造成舒张期静息电位负值减小。ATP敏感性钾通道激活可促

19、进钾离子外流，也可使舒张期电位负值小一点，上述原因可能为RMP升高的原因。动作电位0相的幅度和速度决定于钠通道的开放数量及细胞内外的钠离子浓度差和细胞膜内外的电位差。在动作电位0相的后期还有钙离子电流ICa-f 的参与，H+浓度的增高可使心肌Na+内流减少，H+增高有可抑制缓慢内相电流Isi20，21，ICa-f作为Isi的成分之一，也会受到影响，这样就会使APA及Vmax下降。缺氧再灌注侯克产生一些严重的后果，包括心肌顿抑，再灌注心律失常，不可逆的再灌注损伤，这方面的报道已有很多1，8，而尤为重要的是致死性再灌注室性心律失常的发生2。对于室性心律失常产生的机制是复杂且存在争议，目前最主要的机

20、制是折返及延迟后电位的形成2，3，引起再灌注损伤的机制主要是氧自由基，氧自由基地产生途径有很多，包括黄嘌呤氧化酶系统，中性粒细胞的激活，线粒体及花生四烯酸的代谢等等。氧自由基可使心肌发生顿抑险象，顿抑指的是心肌细胞在经过短暂的缺氧再灌注侯表现了缺氧后的心肌收缩功能的下降32，顿抑代表了一个功能的或非致死性的再灌注损伤。另外氧自由基还可造成心肌细胞膜的流动性、通透性、完整性的改变，导致心肌细胞发生不均匀的电活动，从而成为至折返性心律失常发生的条件。本文在探讨美托洛尔对豚鼠乳头肌细胞动作电位的影响时，结果显示在缺氧再灌注条件下，低浓度美托洛尔组APD短于对照组，但在缺血末APD的缩短未表现出显著性

21、差异，而在再灌注初APD的变化表现显著性差异，变化最明显的是APD30和APD50，提示低浓度美托洛尔在缺氧复灌注状态下抑制了某种离子流，因为APD30和APD50较APD90缩短明显，APD30和APD50大致位于动作电位2相，而参与2相的主要离子流为L-型钙通道。高浓度美托洛尔可能抑制ICa-1而使动作点为缩短。高浓度美托洛尔主要使APD90发生了改变，而APD30、APD50无显著性差异，提示高浓度美托洛尔可能抑制了Ito，而使APD延长。低浓度、高浓度的美托洛尔对缺氧再灌注状态下的APA 、RMP、 Vmax与对照组比较均无显著性差别，提示美托洛尔无膜稳定作用，对INa 无影响。另外，

22、对IKi也可能无影响。由于设备条件所限，本实验所测Vmax较理论上真正的瞬时偏小，在此仅作提示性参考。在缺氧再灌注实验中，低浓度美托洛尔使APD、ERP缩短，高浓度美托洛尔使APD、ERP延长，提示在缺氧再灌注过程中由于细胞内外离子浓度的改变，而使美托洛尔产生电生理作用，正是由于这种作用使美托洛尔在缺氧再灌注过程中对心肌细胞具有保护作用。缺氧再灌注心律失常的发生机制主要与以下三种机制有关，1. 折返现象；2.触发性活动；3.异常的自律性。心肌细胞传导速度减慢和有效不应期缩短是折返现象的原因。高浓度美托洛尔均使ERP和APD在缺氧末与再灌注初较对照组显著性延长，这样就使心肌处于不应性反应的时间延

23、长，从而不利于折返的形成。本实验中，无论低浓度和高浓度美托洛尔组均未发现心律失常，这样就在一定程度上提示美托洛尔可能具有抗缺氧再灌注心律失常作用，在缺血-再灌注过程中可能发挥一定的心肌保护作用。结论1. 美托洛尔正常豚鼠乳头肌的电生理特性无显著性影响。2. 缺氧可使心肌动作电位时程、有效不应期缩短，动作电位振幅降低和静息电位升高，在再灌注20min 左右恢复至正常。3. 低浓度美托洛尔在缺氧再灌注过程中使APD和ERP缩短。4. 高浓度美托洛尔在缺氧再灌注过程中使APD和ERP延长。5. 两种浓度美托洛尔均有抑制缺氧再灌注心律失常作用。 参考文献1. Kloner RA,Przyklenk K

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