基因工程—诞生、原理、技术、应用

1、基因工程诞生、原理、技术、应用专题一专题一 基因工程基因工程一、基因工程的定义一、基因工程的定义按照人们的意愿，按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。定向地改造生物的遗传性状。供体生物供体生物目的基因目的基因剪切和拼接，建构重组剪切和拼接，建构重组DNA分子分子受体细胞受体细胞也称基因拼接技术也称基因拼接技术或或DNA重组技术重组技术二、基因工程的理论依据二、基因工程的理论依据DNA是绝大多数生物的遗传物质，不同生物的是绝大多数生物的遗传物质，不同

2、生物的DNA的基本单位和结构相同的基本单位和结构相同中心法则：中心法则：DNARNA蛋白质蛋白质复制复制转录转录翻译翻译逆转录逆转录复制复制基因是遗传物质结构和功能的基本单位基因是遗传物质结构和功能的基本单位各种生物共用一套遗传密码各种生物共用一套遗传密码三、三、DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具1、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶分子手术刀分子手术刀来源：来源：主要从原核生物中分离提纯主要从原核生物中分离提纯特点：特点：高度的专一性高度的专一性多样性多样性识别并切割特定的某种核苷酸序列识别并切割特定的某种核苷酸序列已经分离出已经分离出4000种种作用：作用：识别双链识别双链DNA分

3、子上某种特定的核苷酸序列，分子上某种特定的核苷酸序列，含有含有48个核苷酸个核苷酸中心轴线两侧的碱基反向对称重复排列中心轴线两侧的碱基反向对称重复排列如如EcoR酶，从中轴线两侧切开，酶，从中轴线两侧切开，如如Sma 酶，沿中轴线处切开，酶，沿中轴线处切开，平切：平切：错位切：错位切：形成平末端形成平末端形成黏性末端形成黏性末端并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开磷酸二酯键断开2、DNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”将双链将双链DNA分子的两个片段连接起来分子的两个片段连接起来 通过形成磷酸二酯键通过形成磷酸二酯键 DNA连接酶：连接

4、酶： 连接黏性末端连接黏性末端T4DNA连接酶：连接酶：连接黏性末端或平末端连接黏性末端或平末端DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶功能的区别：聚合酶功能的区别：DNA连接酶催化两个连接酶催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯片段之间形成磷酸二酯键而连接起来键而连接起来DNA聚合酶催化游离的脱氧核苷酸与聚合酶催化游离的脱氧核苷酸与DNA片段之片段之间形成磷酸二酯键而连接起来间形成磷酸二酯键而连接起来3、基因进入受体细胞的载体、基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”作用：作用： 将目的基因（外源基因）送入受体细胞将目的基因（外源基因）送入受体细胞条件：条件：有一个或多个限制酶切割位点有一个或多

5、个限制酶切割位点在受体细胞中能自我复制，或者能整合到在受体细胞中能自我复制，或者能整合到染色体染色体DNA上，随染色体上，随染色体DNA同步复制同步复制带有标记基因，便于甄别和筛选带有标记基因，便于甄别和筛选安全，对受体细胞无害安全，对受体细胞无害大小合适，方便操作大小合适，方便操作种类：种类： 质粒（经人工改造，常用）、质粒（经人工改造，常用）、噬菌体衍生物、动植物病毒、农杆菌等噬菌体衍生物、动植物病毒、农杆菌等四、基因工程的基本操作程序四、基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取、目的基因的获取从基因组文库中获取目的基因从基因组文库中获取目的基因将某生物的基因组进行切割，获得一批长度将某生

6、物的基因组进行切割，获得一批长度为为1520kb的的DNA片段片段将上述将上述DNA片段分别与运载体结合，再分别导片段分别与运载体结合，再分别导入受体菌群体的各细胞中储存、复制入受体菌群体的各细胞中储存、复制需要时通过一定方法从基因组文库中获取需要时通过一定方法从基因组文库中获取目的基因目的基因构建成该生物的基因组文库构建成该生物的基因组文库限制酶限制酶利用反转录法获取目的基因利用反转录法获取目的基因单链单链DNA（ cDNA ）提取某生物细胞中的提取某生物细胞中的mRNA反转录酶反转录酶DNA聚合酶聚合酶双链双链DNA受体菌细胞中储存、复制，受体菌细胞中储存、复制，建构建构cDNA文库文库P

7、CR技技术扩增术扩增获取目的基因获取目的基因一定方法一定方法导入导入RNADNA杂交分子杂交分子RNA酶降解酶降解RNA链链直接提取后利用直接提取后利用PCR技术扩增而获取目的基因技术扩增而获取目的基因以探针从生物细胞中提取目的基因以探针从生物细胞中提取目的基因利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因人工合成目的基因人工合成目的基因DNA合成仪合成双链合成仪合成双链DNA（目的基因）（目的基因）碱基序列已知碱基序列已知测定某蛋白质中氨基酸的排列顺序测定某蛋白质中氨基酸的排列顺序利用密码子表推测利用密码子表推测mRNA中碱基排列顺序中碱基排列顺序DNA反义链的碱基排列顺序反义链的碱基排列顺

8、序利用碱基互补配对原则推测利用碱基互补配对原则推测化学合成化学合成真核生物的基因结构真核生物的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区外显子外显子内含子内含子初级初级mRNA翻译翻译蛋白质蛋白质启动子启动子终止子终止子转录转录加工加工成熟成熟mRNAPCR技术（聚合酶链式反应）技术（聚合酶链式反应）人工扩增人工扩增DNA技术技术引物引物原理：原理：DNA的半保留复制的半保留复制反应系统：反应系统：微量微量DNA样品样品DNA聚合酶聚合酶4种游离的脱氧核糖核苷酸种游离的脱氧核糖核苷酸模板模板dATP、dTTP、dGTP、dCTP人工合成的含有人工合成的含有20个碱基个碱基 的核苷酸序

9、列的核苷酸序列（过量）（过量）（过量）（过量）退火（退火（55 60 ）, 与引物互补与引物互补在适宜温度下（在适宜温度下（7075）形成）形成DNA新链新链反应过程反应过程样本样本DNADNA聚合酶聚合酶引物引物提高温度（提高温度（9095）,DNA变性变性循环循环进行进行DNA数量数量呈指数方呈指数方式增加式增加PCRPCR技术与体内技术与体内DNADNA复制的区别：复制的区别： 1. PCR 1. PCR不需要不需要DNADNA解旋酶；体内解旋酶；体内DNADNA复制需要；复制需要； 2. PCR 2. PCR需要耐热的需要耐热的DNADNA聚合酶（常用聚合酶（常用TaqDNATaqDN

10、A聚聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性； 3. PCR 3. PCR一般可以经历三十多次循环，短时间内形一般可以经历三十多次循环，短时间内形成大量成大量DNADNA片段；而生物体内片段；而生物体内DNADNA复制需要生物体复制需要生物体自身的复制，形成整个自身的复制，形成整个DNADNA分子。分子。 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建一个基因表达载体包括：一个基因表达载体包括：启动子启动子目的基因目的基因终止子终止子标记基因标记基因其他其他RNA聚合酶的识别和结合位点，聚合酶的识别和结合位点， 驱动基因转录驱动基因转录使受体生物表现出更

11、符合人类使受体生物表现出更符合人类 需求的性状需求的性状结束转录结束转录鉴别筛选出含目的基因的受体细胞鉴别筛选出含目的基因的受体细胞使目的基因稳定存在并遗传使目的基因稳定存在并遗传使目的基因表达和发挥作用使目的基因表达和发挥作用如复制原点、运载体上原有的基因如复制原点、运载体上原有的基因（最核心步骤）（最核心步骤）3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞（1）将目的基因导入植物细胞）将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法农杆菌农杆菌提取提取Ti质粒质粒目的基因目的基因构建构建表达载体表达载体感染感染双子叶植物双子叶植物目的基因目的基因整合整合目的基因插入受体目的基因插入受体细

12、胞染色体细胞染色体DNA裸子植物裸子植物目的基因随染色体目的基因随染色体DNA复制并表达复制并表达常用常用农杆菌农杆菌转入转入基因枪法基因枪法 （适用于单子叶植物）（适用于单子叶植物）花粉管法花粉管法柱头柱头子房壁子房壁胚珠胚珠萌发的花粉粒萌发的花粉粒花粉管花粉管精核精核卵细胞卵细胞极核极核目的基因目的基因简便经济简便经济（2）将目的基因导入动物细胞）将目的基因导入动物细胞 显微注射技术显微注射技术提纯表达载体提纯表达载体显微注射仪注射显微注射仪注射受体动物受精卵受体动物受精卵移植移植雌性动物输卵管或子宫内雌性动物输卵管或子宫内发育发育具有新性状的动物（转基因动物）具有新性状的动物（转基因动物

13、）（3）将目的基因导入微生物细胞）将目的基因导入微生物细胞常态细菌常态细菌Ca2+处理处理感受态细胞感受态细胞表达载体表达载体DNA细菌吸收细菌吸收被转化的细菌（被转化的细菌（含目的基因）含目的基因）混合混合4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定以被标记的目的基因作探针，以被标记的目的基因作探针，与转基因生物基因组与转基因生物基因组DNA杂交，杂交，观察是否出现杂交带观察是否出现杂交带以被标记的目的基因作探针，以被标记的目的基因作探针，与转基因生物提取出的与转基因生物提取出的mRNA杂交，杂交，观察是否出现杂交带观察是否出现杂交带检测转基因生物的染色体检测转基因生物的染色体DNA上是否

14、插入了上是否插入了目的基因目的基因检测目的基因是否转录出检测目的基因是否转录出mRNA分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质目的基因表达的蛋白质（抗原）目的基因表达的蛋白质（抗原）刺激刺激产生相应抗体产生相应抗体从转基因生物体从转基因生物体内提取蛋白质内提取蛋白质抗原抗原 抗体杂交抗体杂交观察是否出现杂交带观察是否出现杂交带检测转基因生物的性状检测转基因生物的性状抗原抗原 抗体杂交技术抗体杂交技术观察或测定是否出现目的基因所决定的性状观察或测定是否出现目的基因所决定的性状抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等人胰岛细胞胰岛素mRNABC胰岛素是治疗糖尿病的重要药物。下图是利用基因工程技术生产胰岛素是治疗糖尿病的重要药物。下图是利用基因工程技术生产人胰岛素时扩增目的基因的过程。请据图回答。人胰岛素时扩增目的基因的过程。请据图回答。（1）人体内能产生胰岛素）人体内能产生胰岛素mRNA的细胞是的细胞是 细胞，不能细胞，不能利用人的皮肤细胞