冻干优化方案

1、冻干优化方案徐秀20140123一.背景介绍1冻干发展背景由于冻干药品呈多孔状、能长时间稳定贮存、并易重新复水而恢复活性,因此冷冻干燥技术广泛应用于制备固体蛋白质药物、口服速溶药物及药物包埋剂脂质体等药品。从国家药品监督管理局数据库得知,目前国内已有注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、注射用重组人干扰素2b、冻干鼠表皮生长因子、外用冻干重组人表皮生长因子、注射用重组链激酶、注射用重组人白介素-2、注射用重组人生长激素、注射用A群链球菌、注射用重组人干扰素2b、冻干人凝血因子V、冻干人纤维蛋白原、间苯三酚口服冻干片等冻干药品获准上市。截止2000年2月,美国FDA已批准的生物技术药共计76个

2、。冷冻干燥技术最早于1813年由英国人Wollaston发明。1909年Shsckell试验用该方法对抗毒素、菌种、狂犬病毒及其它生物制品进行冻干保存,取得了较好效果。在第二次世界大战中,对血液制品的大量需求大大刺激了冷冻干燥技术的发展,从此该技术进入了工业应用阶段。此后,制冷和真空设备的飞速发展为快速发展冷冻干燥技术提供了强有力的物质条件。进入上个世纪后,科学技术的迅猛发展和人民群众对健康保障的需求为药品冷冻干燥技术的飞速发展提供了强大的动力,在药品冻干损伤和保护机理、药品冻干工艺、药品冷冻干燥机等方面取得了巨大的成绩。但药品冷冻干燥技术是一门边缘学科,需要生物学、药学、制冷、真空和控制等知

3、识的交叉和综合,因此仍存在亟待解决的问题。2药品冷冻干燥原理及特点药品冷冻干燥是指把药品溶液在低温下冻结,然后在真空条件下升华干燥,除去冰晶,待升华结束后再进行解吸干燥,除去部分结合水的干燥方法。该过程主要可分为:药品准备、预冻、一次干燥(升华干燥和二次干燥(解吸干燥、密封保存等五个步骤。药品按上述方法冻干后,可在室温下避光长期贮存,需要使用时,加蒸馏水或生理盐水制成悬浮液,即可恢复到冻干前的状态。与其它干燥方法相比,药品冷冻干燥法具有非常突出的优点和特点:a 药液在冻结前分装,剂量准确;b 在低温下干燥,能使被干燥药品中的热敏物质保留下来;c 在低压下干燥,被干燥药品不易氧化变质,同时能因缺

4、氧而灭菌或抑制某些细菌的活力;d 冻结时被干燥药品可形成"骨架",干燥后能保持原形,形成多孔结构而且颜色基本不变;e 复水性好,冻干药品可迅速吸水还原成冻干前的状态;f 脱水彻底,适合长途运输和长期保存。虽然药品冷冻干燥具有上述优点,但是干燥速率低、干燥时间长、干燥过程能耗高和干燥设备投资大等仍是该技术的突出缺点。3药品冻干损伤和保护机理药品冷冻干燥是一个多步骤过程,会产生多种应力使药品变性,如低温应力、冻结应力和干燥应力。其中冻结应力又可分为枝状冰晶的形成,离子浓度的增加,PH值的改变和相分离等情况。因此,为了保护药品的活性,通常在药品配方中添加活性物质的保护剂。二、冻干

5、优化1冻干保护液配方的优化配方中的固体含量会影响冻结和干燥过程。如果固体含量少于2%,那么冻干药品结构的机械性能就会不稳定。尤其在干燥过程中,药品微粒不能粘在基质上,逸出的水蒸气会把这些微粒带到小瓶的塞子上,有时甚至会带到真空室当中。此外,为了获得均匀一致、表面光滑、稳定的蛋白质药品,配方中必须含有填充剂、赋形剂、稳定剂等保护剂,这些保护剂对实现药品的玻璃化冻结有重大的影响。很多糖类或多元醇经常被用于溶液冻融和冻干过程中非特定蛋白质的稳定剂,它们既是有效的低温保护剂又是很好的冻干保护剂,它们对冻结的影响取决于种类和浓度。冻干制品的整个冻干过程存在着各种各样的应力,通常包括低温应力、冻结应力(包

6、括枝状冰晶的形成、离子强度的增加、PH值的改变、相分离等、干燥应力(移去蛋白质表面单层水分子等,这些应力常常是直接或间接导致蛋白质药物不稳定的因素。根据保护剂对抗应力的不同可把蛋白质保护剂初步分为冷冻保护剂和冻干保护剂。一个优良的蛋白质保护剂不仅能够在整个冻干过程中对蛋白质药物起到良好的保护作用,而且能够对成品贮藏期内蛋白质药物的变性起到抑制作用,因为蛋白质药物在贮藏期的变性率往往比在整个冻干过程中的变性率要大。保护剂的分类a糖类:蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖等;糖是最常见、使用最广的一类冻干保护剂,是蛋白质的非特异性稳定剂,在冻干的各个阶段(如冷冻冻融及升华干燥等均能对蛋白质药

7、物起到一定的保护作用。糖的保护作用与其及蛋白质的种类有关。而双糖是研究最多也是公认最有效的保护剂。糖对蛋白质的保护作用大小有时依赖于其浓度,通常在某个浓度范围内糖的保护作用随着浓度的升高而增大,当达到某一浓度时保护作用达到最大值而此后再增大糖的浓度则保护效果不再显著增加有时反而会降低。蔗糖是由一分子葡萄糖及一分子果糖所构成的双糖化学性质稳定,多呈无定型结构。对阻止蛋白质二级结构改变,冻干处理过程中及贮藏期内蛋白质的伸展和聚集起显著作用。海藻糖具有更高的玻璃化温度更低的引湿性更不具有还原性。这些优点均预示着海藻糖可能具有更广阔的应用前景。葡萄糖在冻干过程中可部分保持无定型,对某些蛋白质药物具有一

8、定的保护作用但应该注意的是葡萄糖系还原性糖。在选其作为蛋白质的保护剂时要慎重。b 聚合物:HES、PVP、PEG、葡聚糖、明胶、白蛋白等;通常聚合物的稳定作用取决于聚合物的多重性质,如优先从蛋白质表面析出、表面活性、使蛋白质溶液黏度升高从而阻止其他小分子(如糖及多羟基化合物的结晶、抑制冷冻过程中值的剧烈变化等。c 多羟基化合物:甘露醇、肌醇、聚乙二醇等;甘露醇不仅可作为优良的骨架剂使用而且在一些处方中它能够兼作蛋白质的冻干保护剂。d 表面活性剂:Tween、曲拉通等;吐温、布里杰普朗尼克及十二烷基磺酸钠等一些表面活性剂有时对冷冻及干燥过程中的蛋白质起到一定的保护作用。e 氨基酸:L-丝氨酸、谷

9、氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸等;无定型甘氨酸可阻止冻干过程中,重组人生长激素的聚集结晶型甘氨酸能升高成品的塌陷温度阻止因塌陷而引起的蛋白质药物的破坏。f 盐和胺:磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐等;某些冻干制品中加入盐和胺可获得特定的蛋白质稳定化效果。g蛋白质:BSA、人血清蛋白蛋白质药物本身:一些蛋白质经冻融后的活性直接和蛋白质的起始浓度有关,起始浓度升高有时会促进蛋白质的复性。外来蛋白质类保护剂:为血清白蛋白它是一个经典优良的蛋白质稳定剂。保护剂的选择如何获得稳定的蛋白质冻干制品选择适宜的保护剂至关重要,那么如何去选择适宜的保护剂呢?首先要对被保护的蛋白质药物理化特性有一个充分的了解,继而再通过

10、试验,摸索出在冻干过程及贮藏过程中导致该蛋白质药物不稳定的因素,然后针对这些不稳定性因素选择具体的保护剂。一般而言糖及多羟基化合物是最常用的冻干保护剂。其中蔗糖海藻糖等双糖对一些蛋白质均能显示出良好的保护作用。故在选取冻干保护剂时应给予优先考虑,一个优良的冻干保护剂应该具备多种保护特性。如高的玻璃化温度低的吸湿性能低的结晶速率及不具有还原性基团等。 但任何单一的保护剂都不可能具备所有的保护特性,因此有时还得考虑使用两种或两种以上的保护剂来稳定蛋白质药物 。在考虑合用保护剂时,通常使用不同种类的保护剂能获得显著的保护效果,但是采用尽可能少的辅料种类对实际生产有着重要意义。所以在选择保护剂时要综合

11、考虑多种因素尽量节约成本和减少工作量保护剂对某一蛋白质的保护作用通常有一个最佳的使用浓度或使用量 。故选择保护剂时还要合理选择使用量。附:配方方案计划方案缓冲液体系硼酸缓冲液Tris-HCL 体系磷酸盐体系碳酸盐体系糖类蔗糖海藻糖甘露醇氨基酸甘氨酸聚合物PEG PVP 蛋白质BSA PH7.68.6盐和胺多羟基化合物1.选取配方16种配方,分别冻乳胶标记物和质控品2计划量乳胶每种180只质控品高低各90只100ng/ml,10ng/ml 3观察外观(淘汰不合格配方a外形b复水性好, 药品可形成"骨架",干燥后能保持原形,形成多孔结构而且颜色基本不变冻干药品可迅速吸水还原成冻

12、干前的状态4功能性(淘汰不合格配方冻干前后对比(荧光值和效价均一性(10个平行样线性乳胶标记物:冻干前后荧光值对比。质控品:冻干前后赋值对比2冻干曲线(希望至少3条冻干曲线一般情况下,冻干曲线的选择是三个参数:板层温度/真空度/产品温度.通常来说,冻干曲线的制定是一个固定模式:制订冻干曲线应该知道产品的一些数据和装载情况,作为设定温度,时间和真空的依据,这些数据和情况是:产品的共晶点和崩解点温度,产品冷冻时是否会形成玻璃态,如果会形成玻璃态,产品的回热温度是多少,产品的装载厚度,产品的容器和装载方法,产品的浓度,产品的最高许可温度和干燥后的残水含量等。例如假设某一产品的共晶点是-20,崩解点高

13、于共晶点,产品冷冻时会形成玻璃态,产品的回热温度是-18,产品的装载厚度是12 毫米,小瓶装载并直接放置在板层上,产品的浓度是15%,产品的最高许可温度是30,干燥后残余水分含量要求是2%。要制订冻干工艺曲线。预冻阶段:为了获得产品一致的冷冻结构,产品在5进箱,进箱完毕后保持1 小时,使所有产品从5的同一起点降温到-40,并在-40并保持1 小时,由于产品冷冻时形成玻璃态,因此需做回热处理,把产品加热到-18并保持1 小时,使产品从玻璃态转变为结晶态,然后使产品再次降温,并在-35保持1 小时,预冻阶段结束。升华阶段:板层温度控制在10,使产品的温度维持在-25,比产品的共晶点温度低5,并在此

14、状况下维持15 小时,直到产品中的冻结冰升华完毕为止;冻干箱的真空度控制在产品温度所对应的饱和蒸汽压的30%左右,-25对应的饱和蒸汽压是0.63 毫巴,0.63×30%=0.189 毫巴。解吸阶段:把产品温度加热到最高许可温度30并维持到冻干结束,真空控制在产品温度达到最高温度后停止使用,恢复高真空,在最高许可温度和高真空的状况下保持6 小时,使产品的残余水分达到低于2%的要求。另外,冻干良好的产品应有良好的物理形态,外观无缺损,表面平整,体积与冻结时的体积基本相等,颜色均匀一致,内部疏松多孔,复水迅速而完全,残余水分含量合格,效价高,能长期存放。如果按照某一冻干曲线冻出的产品全部合格,冻干时间也合适,那么该冻干曲线是成熟的曲线。如果干燥后的产品不理想,某些项目不合格,那么要对冻干曲线作适当的调整。5稳定性4和37(2个月(两个月基本可以淘汰稳定性不好分别测4和37的检测值每个星期一次。乳胶标记物每个配方测高低值各5个平行样。(所以每次每个配方需要20只冻干品质控品每个配方测高低值各5个平行样(所以每次每个配方高低值各需要10只冻干品6连续稳定性在合格的配方中再次冻干,