利用 SYBR-GreenI染料和DyNAzymesII聚合酶对基因组DNA进行实时定

1、利用 SYBR-GreenI染料和DyNAzymesII聚合酶对基因组DNA进行实时定    摘要nbsp;本研究对噬菌体和人类基因组nbsp;DNAnbsp;进行定量，扩增反应使用nbsp;DyNAzymesIInbsp;聚合酶，检测使用nbsp;SYBR-GreenInbsp;染料。实验中检测了起始拷贝数范围为nbsp;10nbsp;2nbsp;至nbsp;10nbsp;8nbsp;的噬菌nbsp;     Mimi Amutan and David Batey, Ph.D. 摘要 本研究对噬菌体和人类基因组

2、DNA 进行定量，扩增反应使用 DyNAzymesII 聚合酶，检测使用 SYBR-GreenI 染料。实验中检测了起始拷贝数范围为 10 2 至 10 8 的噬菌体 DNA 和起始拷贝数范围为 75 至 7.5x10 4 的人类基因组 DNA 。噬菌体 DNA 模板四个重复样品 C(t) 标准偏差小于 0.3 个循环说明了检测的准确性。实验证明使用 DyNAzymesII 聚合酶和 SYBR-GreenI 染料对基因组定量是准确而可靠的。 简介 使用实时定量方法有效的对生物样品中的 DNA 和 RNA 定量。定量的试剂包括与 DNA 双链结合的荧光染料和 TaqMan 探针、分子信标等特异性

3、的杂交探针。与 DNA 双链结合 SYBR-GreenI(SG ) 染料因使用简单而被许多定量实验采用。 SG 是一种特异结合双链 DNA 的染料，已被证明能灵敏的检测核酸。 SG 结合双链 DNA 后荧光增强 1000 倍左右，极为适合检测 PCR 扩增产物。由于 SG 能结合于所有双链，因而不能特异性的检测某一特定模板。使用杂交探针要求细心设计引物组，而 SG 仅需要两个用于扩增的引物，无需对其进行标记。 DyNAzymesII 聚合酶在多种扩增反应中产生了很好的结果。这种由 Thermus brockianus 中分离出来的聚合酶比 Taq 酶热稳定性更好，能在广泛的反应条件下保持很好的

4、活性。 SG 对 DyNAzymesII 聚合酶的抑制作用更小。本研究的实时定量 PCR 结果表明使用 DyNAzymesII 聚合酶和 SG 能够精确灵敏的检测到噬菌体和人类基因组 DNA 的初始浓度。 方法 DyNAzyme II DNA 聚合酶购于 Finnzymes (F-503L) 。 SG 和 噬菌 DNA 购于 Molecular Probes (S-7567, P-7589); 人基因组 DNA 购于 Sigma (D-3160). 反应液加入低缘微孔板 (MJ Research MLL-9651) 或八连管 (MJ Research TLS-0251) ，用超净管盖封闭 (M

5、J Research TCS-0803) ，反应体系如表 1 所示。    SG 原液通常为高浓度 (e.g.10,000X). 表中使用的 SG 为 10X SG ， OD 值在 495nm 为 0.4+0.01O.D. 。 SG 用 0.1X TE 缓冲液稀释至 10X 工作液。 扩增 噬菌体 DNA 的引物序列如下（扩增产物 100bp ）： 正向引物： 5-GCA-AGT-ATC-GTT-TCC-ACC-GT-3, 反向引物： 5-TTA-TAA-GTC-TAA-TGA-AGA-CAA-ATC-CC-3 扩增人类基因组中 -actin 基因的引物

6、如下（扩增产物 294bp ）： 正向引物： 5-TCA-CCCACA-CTG-TGC-CCA-TCT-ACG-A-3 反向引物： 5-CAG-CGGAAC-CGC-TCA-TTG-CCA-ATG-G-3 反应液混合后将反应管或反应板放入定量 PCR 仪中，按照表 2 所列的程序进行扩增反应。    阈值线设定为最初的 3 7 个循环荧光值标准偏差的 10 倍。这一阈值自动的应用于所有的孔，使得在该点处对标准品和样品比较产生一致的结果。在任何实验中，标准品和样品的阈值线设定相同十分关键。 以 0.5g/ L 噬菌体 基因组 DNA 为母液制备浓度梯度样品

7、。在 20 L 的反应体系中分别加入 1 L 各稀释度的样品制作标准曲线。用来源于人类胎盘的人基因组 DNA 制备浓度梯度样品，制作标准曲线。 结果 1 噬菌体 基因组 DNA 模板：线性范围与重复性 将荧光信号对循环数作图 (Figure 1a) 表明每一个样品中双链 DNA 的浓度都升高到了背景荧光水平之上，并且都进入了指数扩增期。 C(t) 值（荧光曲线与域值线交叉的点）随着初始模板浓度的增加而成比例的减少，这是因为初始模板浓度高的样品更快的生成足以被 SG 检测到的数量的扩增产物。 噬菌体 基因组 DNA 初始模板拷贝数的线性范围从 10 2 到 10 8 ， 起始模板浓度的对数与对应

8、的 C(t) 值成正比。 Figure 1b 展示的是 100bp 的扩增产物 起始模板浓度的对数与对应 C(t) 值的关系图，回归系数为 0.991 ，表明了极强的线性关系。 对每一个浓度的样品，我们都做了四个重复，通过计算 C(t) 值的差异来验证检测的准确性。如 Table 3 中所示，重复样品间 C(t) 的标准偏差小于 0.3 。    Figure 2 显示了 10 4 拷贝的 噬菌体 DNA 四个重复样品的熔解曲线。随着温度的升高与双链接连结合的 SG 释放，荧光信号也随之平滑的下降。荧光强度随温度变化的负一次倒数也被显示。荧光强度变化的拐

9、点（熔点， Tm ）处清晰地看到了一个单一的峰，大约是在 82°C 。这个峰对应着扩增产物的熔解温度，表明扩增产物为目的产物。荧光强度随温度变化的负一次倒数图中 没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽，表明实验中未出现污染、引物二聚体和假阳性现象。    2 人基因组 DNA 模板：使用标准曲线对患者样品定量 Figure 3 是由人类基因组 DNA 得到标准曲线， 起始拷贝数范围为 75 至 7.5x10 4 ，回归系数 r 2 =0.993 。同时检测了两位患者的基因组 DNA 样品。对照标准曲线，第一位患者样品的初始拷贝数浓度为 254co

10、pies/ L , 第二位患者样品的初始拷贝数浓度为 357copies/ L .    PCR 产物的特异性通过两种方法确定。第一种方法为熔解曲线分析，例如，患者样品 1 的熔解曲线分析显示在 88.5°C 时有一个单一的峰，表明特异的扩增了 -actin ，如 Figure 4 所示。第二种方法是通过凝胶电泳分析 PCR 产物。如 Figure 5 所示每一个标准品和样品都仅有一个电泳条带，表明了除了少量引物二聚体外，特异性的扩增到目的产物。    讨论 1 对于 噬菌体 基因组和人基因组 DNA 都

11、有很宽的线性范围 使用 DyNAzyme II DNA 聚合酶和 SYBR Green I 染料可以成功地对小基因组和复杂的人类基因组进行定量。实验表明至少 6 个数量级的 噬菌体 基因组 DNA 和至少 3 个数量级的人基因组 DNA 的起始模板浓度对数值与对应的 C(t) 值曲线图显示出很好的线性关系。检测线性范围广的特点使其在检测未知浓度的 DNA 样品和浓度范围广泛的样品时极具价值。 本研究中，标准品的下限分别是： 噬菌体 基因组 DNA100 拷贝， 基因组 DNA75 拷贝。其他的研究中得到过保持线性关系的更低的下限浓度。对于一些需要检测到几个拷贝模板量的实验，例如分析很少的细胞数

12、量或者痕量 DNA 样品，较高的灵敏度无疑有着重要的意义。 2 本方法适用于很多应用实例 本文的实验方法可以参考用于很多实验，当然也需要根据具体的要求和条件进行修改。因为 SYBR Green I 可以使双链 DNA 更稳定，为了确保解链完全，可以将变性温度提高 2 。此外，最好利用温度梯度摸索最佳退火温度，可以借助熔解曲线分析和凝胶电泳来评价目的扩增产物的特异性和产量。 3 DMSO 本文的实验方法可用于分析多种样品。用 -actin 的引物扩增人类基因组 DNA 在 扩增的纯度和方便性方面都是一个极好的例子。而通过添加 DMSO 等方法优化反应条件可以帮助扩增难于扩增的模板。 DMSO(

13、二甲亚枫 ) 是一种助解链剂，对于一些以二级结构较强的 DNA 为模板进行的扩增反应而言， DMSO 能降低扩增产物的变性温度。 DMSO 的浓度低于 5 （ v/v ）时都能产生较好的效果。但在反应体系中添加 DMSO 时需格外小心，因为 DMSO 减弱双链 DNA 稳定性的作用会使结合于双链 DNA 的 SG 减少，从而降低荧光信号。添加 DMSO 也会同时降低扩增产物和引物的 Tm 值。 建议实验中逐渐增加 DMSO 的量以摸索最适用量。 4 读板温度的选择可以增加特异性 熔解曲线可以用来分析产物，以消除引物二聚体等副反应产物的影响。为了消除引物二聚体对 C(t) 值的影响，每个循环中的

14、读板温度被调高到了 78 ，这一温度高于引物二聚体的 Tm 值。在这一温度下双链的引物二聚体变性，释放出结合的 SG ，从而消除了引物二聚体产生的荧光信号。在这一温度下较长的 PCR 产物仍保持复性状态，其数量直接反映于荧光强度。读板温度通常设为比特异产物 Tm 值低 3 。通过分析熔解曲线数据可以确定产物和引物二聚体的熔解温度。 这里讨论的结果表明 DyNAzymesII 聚合酶在使用 SYBR-GreenI 染料实时荧光定量 PCR 实验中具有很好的效果。本文列出的方法对于 噬菌体 基因组 DNA 和人基因组 DNA ，都能在较宽的线性范围内得到精确、可重复的定量结果。在使用 SYBR-G

15、reenI 进行实时定量反应的实验中，优化变性、退火温度，考虑使用 DMSO ，选择合适的读板温度，是优化实验结果的一些基本方法。 参考文献   Bustin, S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. (2000) Journal of Mol Endocrinology 25 ,169-193.   Gibson, U.E., Heid, C.A. and Williams, P.M. A nov

16、el method for real time quantitative RT-PCR. (1996) Genome Research 6, 995-1001.   Tyagi, S. and Kramer, F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. (1996) Nature Biotechnology 14 , 303-8.   Morrison, T.B., Weis, J.J. and Wittwer, C.T. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. (1998) Biotechnique