大鼠全脑缺血再灌注损伤神经元Na ,K

1、大鼠全脑缺血再灌注损伤神经元Na ,K     作者：郭芳，吕平，李树民，王永利    【关键词】 Na ,K    Change of Na , K ATPase isoforms in rat neurons damaged by global cerebral ischemia/reperfusion 【Abstract】 AIM: To investigate the change of Na , K ATPase isoforms in rat neurons da

2、maged by global cerebral ischemia/reperfusion. METHODS: The globral cerebral ischemia (15 min) in rats were induced by Pulsinelli 4VO method and the rats were reperfused for 30 min. With RTPCR and immunohistochemical assay, the expression of the Na , K ATPase isoforms was detected in rat hippocampal

3、 and cortical neurons following ischemia/reperfusion. RESULTS: The pyramidal cells during ischemia/reperfusion displayed notable edema. The 1, 2 or 3 isoform of Na , K ATPase distributed in a tissuespecific fashion in neurons of hippocampus and cortex, and 3 isoform was more than 2 and 1 isoforms in

4、 hippocampus, while there was no significant difference in cortex. The expressions of 1 and 3 isoforms in the rats suffering ischemia/reperfusion were significantly decreased in hippocampus (P<0.05 or 0.01). However, the expressions of 1 and 3 in cortex did not change during 15min ischemia and de

5、clined in 30min reperfusion (P<0.05). In both ischemia and reperfusion, the mRNA expressions of 1 and 3 isoforms at mRNA level had no significant change as compared with shamoperated group. CONCLUSION: The change of the expressions of 1 and 3 isoforms may involve in global cerebral ischemia/reper

6、fusioninjury. 【Keywords】 Na , K ATPase; brain ischemia; isoform; reperfusion 【摘要】目的： 研究大鼠全脑缺血再灌注损伤后，神经元Na , K ATP酶亚基三种异构体的变化. 方法： 采用四血管闭塞法（Pulsinelli 4VO）制作全脑缺血15 min再灌注30 min损伤模型，采用免疫组织化学技术和RTPCR的方法，检测缺血及再灌注损伤Na , K ATP酶亚基的改变. 结果： 缺血及再灌注损伤后，神经元明显水肿；假手术组海马和皮层神经元上主要表达有1 和3亚基，且3的含量较1多，缺血15 min及再灌注30 m

7、in后，海马神经元1和3亚基的表达明显减少(P<0.05，P<0.01)，缺血15 min后，皮层神经元1和3亚基的表达无明显改变，而再灌注30 min后表达减少(P<0.05)；缺血及再灌注时1和3亚基在mRNA水平上的表达与假手术组相比无明显改变. 结论： Na , K ATP酶 1和3亚基可能参与了缺血再灌注脑损伤. 【关键词】 Na , K ATP酶；脑缺血；亚基；再灌注 0引言 Na ， K ATP酶（钠泵），是存在于多种真核细胞膜上的多功能蛋白多聚体. 脑缺血缺氧后Na , K ATP 酶活性降低，可导致细胞内Na 增多，渗透压升高，大量的H2O进入细胞内，造成神

8、经元的急性肿胀、变性和坏死，导致细胞外K 增多，使细胞膜持续去极化而影响兴奋传递、递质释放等1. Na , K ATP 酶的结合，转运和药理学的特性取决于其亚单位. 目前关于亚单位在缺血再灌注损伤中的改变少见报道2. 我们采用RTPCR技术和免疫组织化学技术，探讨大鼠全脑缺血再灌注损伤后Na ， K ATP酶亚基在mRNA和蛋白水平上表达的改变，以及Na ， K ATP酶功能异常与缺血性脑损伤之间的关系. 1材料和方法 1.1材料小鼠抗大鼠Na ， K ATP酶1亚单位，兔抗鼠Na ， K ATP酶2, 3 亚单位多克隆抗体购于美国Santa公司；生物素标记的羊抗兔和羊抗鼠IgG，辣根酶标记链

9、酶卵白素购于北京中山生物技术有限公司；反转录试剂盒购于美国Promega公司；其余试剂均为国产分析纯. 健康SD雄性大鼠18只，体质量250300 g，由河北医科大学实验动物中心提供.    1.2方法 1.2.1动物分组将大鼠随机分为3组，每组6只. 假手术组： 麻醉后仅暴露双侧第1颈椎横突板，分离双侧颈总动脉，不电灼凝固双侧椎动脉，不夹闭双侧颈总动脉； 缺血组： 电灼凝固双侧椎动脉，双侧颈总动脉夹闭致全脑缺血15 min；缺血再灌注组： 电灼凝固双侧椎动脉，双侧颈总动脉夹闭致全脑缺血15 min后，松开动脉夹，恢复脑血液灌流30 min. 1.2.2

10、模型制作四血管闭塞法（Pulsinelli 4VO）制作全脑缺血再灌注损伤（Ischemia/Reperfusion，I/R）模型3，水合氯醛腹腔注射麻醉（0.30.35 g/kg）. 暴露双侧第1颈椎横突上翼小孔，电灼凝固双侧椎动脉，造成永久性关闭. 24 h后在大鼠清醒状态下，夹闭双侧颈总动脉，建立全脑缺血模型. 以大鼠1 min内昏迷、双侧瞳孔放大、翻正反射消失为缺血模型成功标准. 15 min后，松开动脉夹，恢复颈动脉血流，以此为再灌注起始点. 1.2.3HE染色缺血及再灌注达预定时间后，迅速断头取脑，沿冠状切面取视交叉后1.25.2 mm，将脑片迅速放入40 g/L多聚甲醛中，固定2

11、472 h. 常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋. 于切片机上行6 m厚冠状切片. 切片常规脱蜡至水，苏木精染色、盐酸乙醇分色、氨水返蓝、伊红复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中型树胶封片. 于光学显微镜下观察大鼠海马和皮层神经元的形态变化. 1.2.4免疫组织化学染色石蜡切片常规脱蜡至水，3 mL/L过氧化氢浸泡以阻断内源性过氧化物酶的作用，正常羊血清工作液封闭，分别用Na ，K ATP酶1, 2, 3 亚单位的三种多克隆抗体作为一抗，150稀释，滴加后4过夜，次日加生物素标记的第二抗体工作液(1100稀释)及辣根酶标记链酶卵白素，37 30 min，DAB显色，苏木素复染后，中性树胶封

12、片，光学显微镜下观察. 采用HPIAS100高清晰病理彩色图文报告分析系统，分析各组亚基表达的变化. 每次实验均设阴性对照，以反应缓冲液代替一抗，结果显示阴性.    1.2.5RTPCR缺血及再灌注达预定时间后，迅速断头取脑，分离海马和皮层组织，分别取组织100 mg，加Trizol 1 mL，冰上静置2 min，12 000 g 4离心5 min，吸上清至Ependoff管，加入氯仿200 L，剧烈震荡，冰上静置15 min， 12 000 g 4离心15 min，吸取上清至Ependoff管中，加入500 L异丙醇，混匀，-20静置30 min，1

13、2 000 g 4离心10 min，弃去上清，加入750 mL/L乙醇1 mL，12 000 g 4离心5 min，弃去上清液，室温干燥10 min，加DEPC水20 L混匀，取1 L上样，10 g/L琼脂糖凝胶电泳，分析RNA完整性. 取1 L稀释100倍，紫外分光光度计测A值与RNA浓度. RTPCR引物：1上游引物为5AAG GAC GCC TTT CAG AAT GCC T3，下游引物为5TGA CCA TGA TGA CCTT AAT CC 3，产物长度为247 bp. 3上游引物为5GAC CCC AAT GAC AAC CGA TA 3，下游引物为5CAT GGA CAT GAG

14、 ACC CAC GAA 3，产物长度为285 bp. GAPDH 上游引物为5ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC 3，下游引物为5TCC ACC ACC CTG TTG CTG TT 3，产物长度为452 bp. 反转录：吸取RNA 1 g，70变性10 min，取DEPC水 7.2 L，Buffer 2 L，dNTP 2 L，2.5 mmol/L Mg2 4 L，OligdT 1 L，RNA酶抑制剂0.5 L，RNA 2.5 L，AMV 0.8 L，42 1560 min，95 5 min灭活. PCR反应：Buffer 5 L，dNTP 4 L，GAPDH上游引物

15、60;   1.3 L，GAPDH下游引物1.3 L，1 上游引物 2.2 L，1 下游引物1.9 L，Taq DNA聚合酶 0.4 L，反转录产物 2 L，加水至50 L，94预变性5 min，94变性40 s，45退火45 s，72延伸45 s，共30个循环，72延伸10 min. PCR产物6 L，与上样缓冲液混合后进行15 g/L琼脂糖电泳，凝胶成像系统拍照， Bio1D软件进行图像分析，测定产物条带的光密度，计算目标产物与GAPDH的比值. 统计学处理： 实验数据用x±s表示. 采用SPSS 10.0软件进行样本方差分析及SNKq检验. 2结果

16、 2.1海马和皮层神经元形态变化假手术组海马及皮层锥体细胞，排列整齐紧密，细胞核大而圆、透明，有12个明显核仁. 缺血15 min组及再灌注30 min组，锥体细胞尼氏小体消失，细胞间隙扩大，可见红色神经元，表明细胞出现明显的水肿（图1）. A: 正常海马神经元形态结构；B:缺血15 min 海马神经元形态结构；C:再灌注30 min海马神经元形态结构. 图1缺血及再灌注损伤海马神经元的改变HE ×200（略） 2.2海马和皮层神经元Na ，K ATP酶亚基表达的变化假手术组大鼠海马和皮层神经元主要分布有Na ，K ATP酶的1和3亚基，而少有2的表达，海马神经元3亚基的表达多于1亚

17、基，皮层神经元上两种亚基的表达无显著性差异. 大鼠全脑缺血15 min和再灌注30 min后，海马神经元1和3亚基的表达均明显减少，皮层神经元的1亚基在缺血15 min后无明显改变，而3亚基有明显改变，在再灌注后30 min， 1和3亚基均有明显减少（图2，表1）.    A:正常皮层神经元1亚基的表达；B:缺血15 min 皮层神经元1亚基的表达；C:再灌注30 min皮层神经元1亚基的表达. 图2缺血及再灌注损伤海马神经元1亚基的改变免疫组织化学染色 ×200（略） 表1Na ， K ATP酶1和3 亚基的表达（略） aP<0.05

18、vs假手术； bP<0.05 vs 1亚基. 2.3Na ， K ATP酶1和3 亚基的mRNA的表达假手术组海马神经元3亚基mRNA的表达多于1亚基，皮层神经元上两种亚基的表达无明显的差异. 大鼠全脑缺血15 min和再灌注30 min后，海马神经元和皮层神经元钠泵两种亚基mRNA的表达均无明显的改变（图3，表2）. 3讨论 脑组织Na , K ATP 酶对缺血缺氧非常敏感，脑缺血缺氧后可致其活性降低4. 缺血及再灌注对Na ，K ATP酶活性的影响有着区域性的差异，缺血后海马突触体Na ，K ATP酶活性立即下降，而新皮层部位的酶活性却有升高趋势，再灌注后各区Na ，K ATP酶活性

19、均减低5.    1, 3: 海马1亚基; 2, 4: 海马 3亚基; M: marker; 5, 7: 皮层1亚基; 6, 8: 皮层3亚基. 图3大鼠全脑缺血后脑组织Na ，K ATP酶 亚基RT PCR产物电泳（略） 表2Na ，K ATP酶亚基mRNA的表达（略） aP<0.05 vs 1亚基. 我们在实验中探讨了缺血及再灌注损伤Na ，K ATP 酶 亚基在蛋白水平上的改变，结果表明海马和皮层亚基在缺血及再灌注损伤中的反应性的不同，其原因可能在缺血期皮层体积较大，且血管网密度高，能量供应相对较丰富，可代偿性的维持Na ，K ATP酶活性. 而在再灌注期则失代偿6. 在mRNA水平上，海马神经元和皮层神经元亚基mRNA的表达与蛋白的表达不一致，其可能的原因 与基因转录后调节有关，从mRNA 翻译为蛋白的过程中受到多种因素的调节,而这种转录后调节在不同亚单位间可能存在差异； mRNA 与蛋白的半衰期不同，mRNA 极易降解,在组织内存在时间较短,而翻译成蛋白后性质相对稳定； 正常状态下细胞内可能有一定量的Na ，K ATP 酶储备，不行使功能,而这种储备量的多