自身免疫性感音神经性聋的内耳代谢与电生理研究

1、    自身免疫性感音神经性聋的内耳代谢与电生理研究谭长强1曹银成1胡平2童素琴3何学勤1 摘要为探讨自身免疫性感音神经性聋(ASHL)的内耳病理生理学机制，采用听觉电生理技术和酶组织化学方法，观察ASHL模型动物的内耳生理功能与组织内主要酶活性的变化。结果示：听神经复合动作电位和耳蜗微音器电位阈值明显升高，内淋巴电位(包括负相)幅值均有不同程度的降低，并与血管纹和内淋巴囊局部组织内Na+-K+-ATP酶和琥珀酸脱氢酶活性改变之间有相关性。表明自身免疫性内耳损伤，进而造成组织内相关酶代谢异常，是听觉功能障碍的病理基础。 关键词自身免疫病感音神经性聋酶组织

2、化学内淋巴电位 The experimental research of inner ear metabolism and electrical physiology of autoimmune sensorineural hearing loss Tan ChangqiangCao YinchengHu Pinet al (Department of Otorhinolaryngology,Affiliated Hospital of Nanjing Railway Medical College,Nanjing 210009) AbstractInquire into the mechan

3、ism of inner ear pathological physiology in autoimmune sensorineural hearing loss(ASHL).With the auditory electric-physiological techniques and enzyme-histochemical method,the change of inner ear hearing function and enzyme active were observed.These animals,which threshold of auditory nerve compoun

4、d active potential(CAP) and cochlear microphonic potential(CM) heightening evidently,showed that the amplitude of endolymphatic potential(EP) (include-EP) bring down in various degress,which was related to the change of the active of Na+-K+-ATPase and SDH in vascularis stria and endolymphatic sac.Th

5、e abnormality of enzymes metabolism in inner ear tissues,which following autoimmune inflammation damage,is the pathological foundation of hearing dysfunction. Key wordsAutoimmune diseaseSensorineural hearing lossEnzyme-histochemistryEndolymphatic potential 自身免疫性感音神经性聋(autoimmune sensorineural hearin

6、g loss,ASHL)作为目前少数可以有效治疗的感音神经性聋(sensorineural hearing loss,SNHL)之一，对其研究工作已越来越受到耳科学者们的重视。研究证实，同种内耳抗原(isologous inner ear antigen,IIEAg)免疫可造成ASHL动物模型；并行体液与细胞转移免疫均获得成功；针对内耳组织的特异性抗体和淋巴细胞可经体液循环到达内耳局部；内淋巴囊(endolymphatic sac,ES)在其中起着重要作用14。本研究通过对ASHL模型动物进行各项听觉电生理指标与内耳组织酶活性变化的观察，旨在进一步探讨本病的内耳病理生理学基础。 1材料与方法

7、1.1材料选择 择健康、白毛红眼豚鼠36只，体重300450 g，耳廓反射正常，耳镜检查排除中耳疾患。麻醉均采用3%戊巴比妥钠，按30 mg/kg腹腔注射。 豚鼠粗制内耳抗原按文献1制取方法制取。IIEAg 400 mg/0.4 ml加等量完全弗氏佐剂，注射于右后足垫；2周后以IIEAg 200 mg/0.4 ml加等量不完全弗氏佐剂，注射于背部多点皮下；间隔2周后，再同样强化免疫1次1。 将36只动物随机分成2组：第1组：24只，经IIEAg免疫后，测试每只实验动物的特异性体液和细胞免疫反应与双耳的听觉诱发电位；依据其听觉诱发电位测试结果，再分为出现听觉损伤的ASHL模型动物组(A组)和未出

8、现听觉损伤的非ASHL模型动物组(B组)；第2组(即C组)：12只，采用磷酸盐缓冲液代替IIEAg进行免疫作为对照，各项观察指标的测试情况同第1组。 1.2观察方法 1.2.1特异性抗体测定：分别取免疫前和末次免疫后2周的血清，行酶联免疫吸附试验(ELISA)2。IIEAg浓度为100 g/ml，血清稀释度为15，酶结合物为protein A-HRP，测定波长490 nm的吸光度(A值)。 1.2.2特异性细胞免疫反应测定：免疫前和末次免疫后3周，采用3H-TdR掺入法淋巴细胞转化试验2，抗原同上，测定刺激指数(stimulation index,SI)。 1.2.3听觉诱发电位测定：采用面神

9、经管电极，于免疫前和末次免疫后3周，分别用Click和短纯音(0.5 kHz、2 kHz、10 kHz)测试听神经复合动作电位(auditory nerve compound active potential,CAP)和耳蜗微音器电位(cochlear microphonic potential,CM)。方法依文献2进行。 1.2.4内淋巴电位测定：末次听觉诱发电位测定后，采用颈部切口，打开听泡，在手术显微镜下将玻璃微电极插入蜗管内，测定内淋巴电位(endolymphatic potential,EP)；并用缺氧法，测定负相EP(-EP)。 1.2.5内耳酶组织化学试验：EP测定后，断头，取出

10、颞骨，进行基底膜(basement membrane,BM)铺片、肝脏包埋螺旋韧带(spiral ligament,SL)和明胶包埋ES冰冻切片，分别采用Guth钙钴法和Nachlas四唑盐法行酶组织化学试验，观察Na+-K+-ATP酶和琥珀酸脱氢酶(SDH)活性。 2结果 2.1血清特异性抗体水平 以免疫前各组动物A值的加2s作为判断标准，第1组有14只动物免疫后抗体水平明显升高(表1)。 2.2特异性细胞免疫反应 以免疫前各组动物SI的加2s作为判断标准，第1组有10只动物免疫后SI值明显升高，即出现针对IIEAg的特异性细胞免疫反应(表1)。 表1ASHL模型动物免疫和听力指标测值 编号

11、 抗体水平(A值) 细胞免疫(SI) CAP阈值(dB) CM伪阈*(dB) 免疫前 免疫后 免疫前 免疫后 免疫前 免疫后 免疫前 免疫后 A1 0.49 0.73 0.91 1.02 10 25 38.33 50.00 A2 0.55 0.62 1.03 1.58 10 20 43.67 58.33 A3 0.47 0.81 1.07 1.39 5 30 35.00 51.67 A4 0.47 0.90 0.96 1.61 15 25 38.33 53.33 A5 0.52 1.02 1.10 1.56 5 25 46.67 68.33 A6 0.50 0.71 1.00 1.29 5 1

12、5 33.33 53.33 A7 0.44 0.68 0.98 1.53 10 30 45.00 56.67 A8 0.53 0.96 1.08 1.17 10 40 36.67 55.00 A9 0.50 0.88 1.02 1.67 5 20 43.33 63.33 A10 0.51 0.78 1.05 1.42 10 35 35.00 58.33 A1、A2为A组动物实验的编号，下同*CM伪阈为三个频率的均值  2.3听觉功能检测 CAP、CM测值见表1。 表1可见，以免疫后CAP阈值升高15 dB以上作为判断听力损伤标准，第1组7只动物出现听觉损伤。以免疫后任一频率

13、CM伪阈升高15 dB以上作为判断听力损伤的标准，第1组有9只动物出现听觉损伤。 2.4ASHL动物模型判断 以血清特异性抗体水平升高或出现特异性细胞免疫反应，加上CAP或CM阈值升高，作为判断ASHL模型动物标准，第1组有10只动物诱发出ASHL病变，即A、B两组动物数分别为10只和14只。 2.5内淋巴电位测值 EP值在C组较为恒定，正相EP为78 mV，负相EP均值为56 mV；分别以EP 减2 s再减10 mV，和以-EP加2s，再加10 mV，作为判断标准，显示A组EP值有7只动物、-EP值有9只动物出现异常(表2)。 2.6内耳组织酶活性 组织酶活性显示如表2和附图。附图中可 表2

14、ASHL模型动物的EP测值与酶学状况 编 号 EP(mV) ATP酶* SDH酶* 正相 负相 SL BM ES SL M ES A1 70 51 A2 60 40 A3 58 35 A4 60 43 A5 54 33 A6 62 40 A7 64 36 A8 61 41 A9 57 33 A10 55 39 *ATP酶和SDH在各组织中的活性均依光镜视野下显色物的含量分为4个等级 见，与C组相比，A组动物血管纹(stria vascular,SV)内黑色沉淀物明显为少，即Na+-K+-ATP酶活性降低；SV、BM和ES内蓝色沉淀物减少，即SDH活性亦有显著差异。表2示：B组部分动物SV内SD

15、H活性降低，但ES和BM内无明显差异。 附图组织酶活性 a：为采用A组和C组动物血管纹的肝脏包埋冰冻切片所制作的SDH组化染色光镜照片，可见A组动物的SDH活性明显低于C组动物 b：为采用A组和C组动物血管纹的肝脏包埋冰冻切片所制做的Na+-K+-ATPase组化染色光镜照片，可见A组动物的酶活性明显低于C组动物 3讨论 以往研究中发现，内耳局部的免疫损伤可造成内耳组织结构的病理改变和生理功能障碍4，5。同种内耳抗原免疫后，可诱发内耳组织免疫炎性病理改变和听觉功能障碍。电镜观察显示，在血管纹、螺旋神经节、内淋巴囊等部位的组织细胞内，出现不同程度的病理变化6，7，提示自身免疫性损伤所造成的SNH

16、L可能与内耳组织代谢障碍有关，但至今无该方面研究报道。 本文资料显示，经IIEAg免疫后，部分动物出现明显的特异性体液与细胞免疫反应和听觉功能障碍，即造成ASHL动物模型。在此基础上进一步观察发现，模型动物有不同程度的内耳组织酶活性改变和EP异常，尤其是直接参与能量代谢的Na+-K+-ATP酶活性降低，进而造成作为Corti器生物电转换基础的EP正负相值缩小；在以往的研究中已经证实ES在内淋巴液代谢、尤其是大分子物质的吸收与清除方面，具有极其重要的作用。本研究发现，SDH在部分非ASHL动物的SV内亦出现活性的降低，而在ES和BM部位的变化仅发生在ASHL模型动物，提示ES局部的自身免疫性病变

17、，进而造成蜗管内(包括BM)的病理改变和听觉功能障碍，与SDH代谢活性的异常有关。 综上所述，从酶分子水平、并观察了内耳代谢重要指标之一的EP在ASHL中的变化，证实存在有内耳组织酶活性异常和内淋巴电位的改变，SV、BM和ES中Na+-K+-ATP酶活性的降低可能与自身免疫性损伤有关，由此进而造成SV和ES等组织器官的功能障碍，即在本次实验中显示EP值降低，在此基础上进一步造成内耳生理功能障碍，从而出现本病所特有的组织病理形态学和内耳听觉功能损伤等一系列表现。 参考文献 1杨湘宁，钟启明，武淮波，等.同种内耳抗原免疫豚鼠致感音神经性聋的实验研究.中华耳鼻咽喉科杂志，1992，27：3 2谭长强

18、，刘桦，胡平，等.自身免疫性感音神经性聋体液与细胞转移免疫研究.中国学术期刊文摘(科技快报)，1996，2：113 3谭长强，钟启明，武淮波，等.内淋巴囊在自身免疫性感音神经性聋发病机理中作用的实验研究.耳鼻喉学报，1993，7：129 4Woolf NK.Coclear pathophysiology associated with inner ear immune responses.Acta Otolaryngol,1986,102:353 5Tikada K,Yamawaki T,Suzumo R,et al.Altera-tions of charge barrierin the inner ear following immune reactions.Ann Otol