基因定位及克隆

1、胡正茂胡正茂 基因定位方法strategy for gene mapping 染色体多态法（chromosome heteromorphism） 染色体畸变法(chromosome abnormality) 体细胞杂种法(somatic cell hybrids) 染色体分类法(chromosome sorting ) 原位杂交法（FISH） 剂量分析法(dosage ananlysis) 测序法（sequencing） 家系分析法 （pedigree ananlysis）染色体多态法.主要限于性染色体上的定位，根据某些性状或疾病在男女性别间的差异，结合系谱分析，将这些基因定位在X染色体上。D

2、uffy 血型基因定位于1号染色体上 (Donahue在做染色体实验时发现自己的1号染色体长臂在靠近着丝粒区的地方变长了，通过对他自己家族成员染色体的观察发现，这一异常是遗传的，将其作为1号染色体上的一个特定的标记，随后发现这一标记与Duffy血型具有平行性，表明这种染色体的异常结构同这一基因相连锁，因此将此血型基因定位于1号染色体上。)染色体畸变法 畸变常涉及两个位点，如果这两个位点之一正好是某一功能基因所在的位置，染色体的畸变则肯破坏该基因的正常功能而引起疾病，根据染色体畸变的位置和疾病发生的关系，则可将致病基因定位于染色体的某一特定位置上。染色体异常进行基因定位染色体异常进行基因定位-睾

3、丸决定因子睾丸决定因子Testis determining factor体细胞杂种法 体细胞杂种通常由人和鼠的体细胞融合而成。这些融合细胞在最初几代培养过程中具有选择性丢失人类染色体趋势，而保留所有的鼠染色体。 保留在融合细胞中的染色体可以是多条，也可能只有一条甚至某条染色体的一部分。 根据研究的需要可将含有不同人类染色体的人鼠杂种细胞组合成人鼠杂种细胞板(hybrid panel)，结合杂种细胞板和PCR的方法或基因剂量分析，或蛋白质表达分析，可将相应的基因定位到特定的染色体或染色体片段上，该杂种细胞板在人类基因定位以及人类基因组计划中发挥过重要的作用。 体细胞杂交基因定位示意图 Mille

4、rMiller等运用体细胞杂交证明胸苷激酶（等运用体细胞杂交证明胸苷激酶（TKTK）位于人的）位于人的1717号染色体，这是首例应用体细胞杂交法进行的基因定位。号染色体，这是首例应用体细胞杂交法进行的基因定位。原位杂交法（FISH） 如果一个基因或基因的某一部分已经被克隆，则可将该基因用同位素或荧光标记和染色体原位的分子杂交，在染色体上恒定出现信号的区域即该基因在染色体上的位置。同一染色体上的多个不同的基因可用不同的荧光标记来鉴别他们在染色体上的相对位置，运用这一方法在中期染色体上，可区分两个相隔约2Mb的基因；在间期染色体上，据称可鉴别仅相隔50kb的两个基因。 CONNEXIN31.1候选

5、克隆：根据基因的功能、结构及已有的研究发现，预测可能与目的新基因有关的疾病，然后在相应患者中检测该基因的突变情况。位置克隆：目前最常用的方法，将某一疾病的致病基因用连锁分析的方法定位在某一染色体的特定位置上或区域内，然后在该位置上或区域内鉴定其致病基因。连锁分析原理u生殖细胞在减数分裂时发生交换，一对同源染色体上存在着两两相邻的基因座位，若两者之间距离较远，发生交换的机会较多，则出现重组次数就多；若两者之间距离较近，则重组机会较少。u连锁分析就是根据基因在染色体上呈线性排列，不同基因相互连锁成连锁群的原理，即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位。1 12 23

6、3基因分型基因分型GenotypingGenotyping 除性染色体外，每个人体内的染色体都有两份。除性染色体外，每个人体内的染色体都有两份。一个人所拥有的一对等位位点的类型被称作基因型一个人所拥有的一对等位位点的类型被称作基因型genotype。 对对SNP位点而言，一个人有三种可能性，分别是位点而言，一个人有三种可能性，分别是AA，AG或或GG 。这种基因型的差异叫做单核苷酸。这种基因型的差异叫做单核苷酸多态性多态性(SNP)。通过实验确定某个个体在某个多态性位点的基因型，通过实验确定某个个体在某个多态性位点的基因型，被称作基因分型。被称作基因分型。 几种多态标记几种多态标记: :（1）

7、RFLPs（2）STRPs（3）SNPs 第一代标记：第一代标记： RFLP（restriction fragment length polymorphism）。）。 限制性内切酶可在特定的核苷酸位置切割限制性内切酶可在特定的核苷酸位置切割DNADNA。DNADNA序列的改变甚至是一个碱基的改变，都可能改序列的改变甚至是一个碱基的改变，都可能改变限制性内切酶酶切片段的长度，通过凝胶电泳可变限制性内切酶酶切片段的长度，通过凝胶电泳可以方便地检测这种长度的以方便地检测这种长度的“多态性多态性”。RFLPRFLP在整个在整个基因组中都存在，根据对基因组中都存在，根据对RFLPRFLP片段的多态性分析

8、，片段的多态性分析，可对某些疾病进行诊断并将与疾病有关的基因进行可对某些疾病进行诊断并将与疾病有关的基因进行定位。定位。/projects/genome/probe/doc/TechRFLP.shtml 19801980年，年，BotsteinBotstein首次提出。首次提出。 使用特殊的外切酶切断使用特殊的外切酶切断DNADNA中特殊位点中特殊位点 19871987年，年，第一张较完整的人基因连锁图第一张较完整的人基因连锁图, ,包含包含393393个个RFLPRFLP位点。位点。 缺点：数目少，信息量小；成本昂贵，操作繁缺点：数目少，信

9、息量小；成本昂贵，操作繁琐，不易发展到自动化水平。琐，不易发展到自动化水平。 第二代标记第二代标记: :STR (short tandem repeat polymorphism)。例如。例如基因组中两个或两个基因组中两个或两个以上的核苷酸短串联重复以上的核苷酸短串联重复序列序列(CA)n(CA)n，微卫微卫星标记等，星标记等，在不同个体中重复单位的数目变在不同个体中重复单位的数目变异非常大。异非常大。微卫星标记荧光电泳图 STRSTR广泛存在于人基因组，占约广泛存在于人基因组，占约5%5%，基本单，基本单位是位是2bp-6bp2bp-6bp的的串联重复，其中以串联重复，其中以(CA)(CA)

10、n n ，(GT)(GT)n n常见。常见。 19961996年建立了以年建立了以60006000多个多个STRSTR为主体的遗为主体的遗传图谱，目前有传图谱，目前有1000010000个左右的位点。个左右的位点。 主要用于个体识别主要用于个体识别 优点：信息量大；易实现自动化。优点：信息量大；易实现自动化。 缺点：标记数量不够多缺点：标记数量不够多 随着人类基因组计划、国际人类基因组单体型计划（Hapmap计划）的完成，大量的SNP被发现。利用先进的高通量基因芯片技术，精确揭示重大疾病的基因变异，从而阐明疾病的遗传学发病机制，是目前科学界公认的最为有效的搜寻重大疾病易感基因的研究方法，被Sc

11、ience杂志评为2007年十大科学进展之首。 迄今已发现的迄今已发现的SNPSNP约约9009001,0001,000万个，万个，相关的文章约相关的文章约40004000余篇。余篇。 特点：特点： 数量丰富数量丰富 双等位标记，简单的双等位标记，简单的+/-+/-分析分析 根据结果可以估算出某个等位基因在一根据结果可以估算出某个等位基因在一个群体中的频率个群体中的频率 易于实现自动化，快速筛查易于实现自动化，快速筛查SNP作为遗传标记的优势作为遗传标记的优势在家系中，重组率是进行连锁分析的基础在家系中，重组率是进行连锁分析的基础L()= r(1-)n-r=1(1-)4Lods=lg【(0.2

12、*0.84)/0.55】=0.4185Lods=0.1249L()= r(1-)n-r=1(1-)4/2+4(1-) /2Lod score结果判定：结果判定： Lod3肯定连锁，肯定连锁，Lod-2否定连锁，否定连锁， -2Lod1则还需增加样本资料。则还需增加样本资料。20102010年在国内最早应用外显子组测序技术克年在国内最早应用外显子组测序技术克隆了一个新的共济失调致病基因隆了一个新的共济失调致病基因TGM6TGM62004年年定位与克隆角膜定位与克隆角膜环状皮环状皮样瘤基因样瘤基因 角膜环状皮样瘤角膜环状皮样瘤是一种先天性角膜良性肿瘤，呈是一种先天性角膜良性肿瘤，呈常染色体显性遗传

13、，以双侧眼球角膜缘处环形淡常染色体显性遗传，以双侧眼球角膜缘处环形淡黄色肿块为特征，可延伸到结膜，患者可出现视黄色肿块为特征，可延伸到结膜，患者可出现视力的改变如弱视、斜视和散光。力的改变如弱视、斜视和散光。 皮样瘤由外胚层包括角化的上皮、毛发、皮脂腺皮样瘤由外胚层包括角化的上皮、毛发、皮脂腺和中胚层包括纤维组织、脂肪组织、血管组成和中胚层包括纤维组织、脂肪组织、血管组成角膜环状皮样瘤家系图角膜环状皮样瘤家系图 I:1I:2II:1II:2II:3II:4II:5 II:6II:7 II:8II:9II:10II:11II:12II:13II:14 II:15II:16III:1 III:2

14、III:3III:4III:5 III:6III:7 III:8IV:1 IV:2IV:3IV:4 IV:5IV:6III:9 III:10 III:11III:12IV:7IV:8III:13III:14 III:15III:16IV:9III:17III:18 III:19III:20 III:21IV:10III:22 III:23 III:24 III:25III:26III:27基因组扫描的流程DNA抽提抽提利用利用STR引物多重引物多重 PCRGenotype 基因分型基因分型Linkage 连锁分析连锁分析侯选基因，突变检测侯选基因，突变检测定位基因定位基因多重PCR 使用使用P

15、E公司一套覆盖基因组公司一套覆盖基因组22条常染色体、高杂条常染色体、高杂合度的微卫星位点引物，一共合度的微卫星位点引物，一共382对。对。 采用采用Touchdown程序结合多重程序结合多重PCR反应方法，反应方法，将将512种不同引物混合种不同引物混合,放入同一管中进行扩增，放入同一管中进行扩增，总反应体积总反应体积5l疾疾病病位位点点和和染染色色体体 4 4q q2 24 4- -2 26 6 上上 1 15 5 个个标标记记之之间间的的两两点点 L LO OD D 值值 LOD SCORE AT = LOCUS Genetic distance 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

16、Zmax D4S1560 104.75 -2.50 1.25 1.17 0.86 0.45 1.25 D4S2966 106.89 3.41 2.87 2.26 1.57 0.81 3.41 D4S1572 107.95 3.91 3.41 2.72 1.88 0.93 3.91 D4S1570 109.02 3.58 2.98 2.31 1.56 0.73 3.58 D4S1564 112.62 6.07 5.04 3.90 2.66 1.30 6.07 D4S2945 116.37 5.04 4.21 3.30 2.27 1.11 5.04 D4S2989 117.06 6.72 5.64

17、 4.44 3.09 1.55 6.72 D4S1616 117.06 5.01 4.33 3.47 2.43 1.21 5.01 D4S406 117.06 2.33 1.91 1.45 0.95 0.39 2.33 D4S193 117.06 6.07 5.08 3.97 2.74 1.35 6.07 D4S1613 121.61 6.63 5.57 4.38 3.05 1.53 6.63 D4S1522 123.13 0.64 3.93 3.31 2.38 1.21 3.93 D4S1612 124.45 -3.79 1.85 1.59 1.14 0.60 1.85 D4S402 124

18、.45 -1.97 1.87 1.63 1.19 0.63 1.87 D4S427 124.45 -3.69 1.40 1.19 0.76 0.32 1.40 以上结果说明这个单体型在该家系中与疾病共分以上结果说明这个单体型在该家系中与疾病共分离，而这些重组事件的发生则将角膜环状皮样瘤疾离，而这些重组事件的发生则将角膜环状皮样瘤疾病基因定位于病基因定位于4q24-26的的D4S1572和和D4S1522之间之间15.2 cM范围内范围内侯选基因的筛选侯选基因的筛选 首先进行首先进行UCSC数据库（数据库（April, 2003）查询）查询D4S1572-D4S1522之间之间15.2cM的基因

19、资料的基因资料 ，结，结果显示在这个区间总计有果显示在这个区间总计有65个个known genes,52个个Reference genes 进行候选基因筛选时，考虑到组织发生中皮样瘤进行候选基因筛选时，考虑到组织发生中皮样瘤为异位到角膜的正常组织，推测角膜环状皮样瘤为异位到角膜的正常组织，推测角膜环状皮样瘤致病基因可能与胚层的移行、细胞的发育和分化致病基因可能与胚层的移行、细胞的发育和分化密切相关密切相关侯选基因的筛选侯选基因的筛选 通过筛选，选取其中通过筛选，选取其中3个能与组织细胞的发育分化个能与组织细胞的发育分化和移行有关并在眼睛表达的基因：和移行有关并在眼睛表达的基因： CXXC4 P

20、ITX2 TM4SF9神经性耳聋疾病基因神经性耳聋疾病基因GJB3GJB3的克隆的克隆 Mouse Gjb3 120(ATG) 82% 765 932 (TGA) Rat Gjb3 80(ATG) 83% 725 892(TAA) 5 Contig 3 69(ATG) 719 af ar AA078777 AA079696 bf bc br 3RACE 5 69 (ATG) Human GJB3 881 (TGA) 1059GJB3GJB3基因的计算机克隆基因的计算机克隆共获得共获得cDNA 片段片段1059bp，其中其中 ORF 813bp，编码的氨基酸，编码的氨基酸 270aa个。个。蛋白

21、质的结构蛋白质的结构: 4个跨膜区个跨膜区 2个胞外区个胞外区 3 个胞内区个胞内区Gjb2_MOUSE MDWGTLQSILGGVNKHSTSIGKIWLTVLFIFRIMILVVAAKEVWGDEQADFVCNTLQPGCGjb2_RAT MDWGTLQSILGGVNKHSTSIGKIWLTVLFIFRIMILVVAAKEVWGDEQADFVCNTLQPGCGJB2_HUMAN MDWGTLQTILGGVNKHSTSIGKIWLTVLFIFRIMILVVAAKEVWGDEQADFVCNTLQPGCGjb2_SHEEP MDWSALQTILGGVNKHSTSIGKIWLTVLFIFRIMIL

22、VVAAKEVWGDEQADFVCNTLQPGCGjb6_MOUSE MDWGTLHTVIGGVNKHSTSIGKVWITVIFIFRVMILVVAAQEVWGDEQEDFVCNTLQPGCGJB1_HUMAN MNWTGLYTLLSGVNRHSTAIGRVWLSVIFIFRIMVLVVAAESVWGDEKSSFICNTLQPGCGjb1_RAT MNWTGLYTLLSGVNRHSTAIGRVWLSVIFIFRIMVLVVAAESVWGDEKSSFICNTLQPGCO18968 MNWTGLYTLLSGVNRHSTAIGRVWLSVIFIFRIMVLVVAAESVWGDEKSSFICNTLQP

23、GCGjb1_MOUSE MNWTGLYTLLSGVNRHSTAIGRVWLSVIFIFRIMVLVVAAESVWGDEKSSFICNTLQPGCGjb1_XENLA MNWAGLYAILSGVNRHSTSIGRIWLSVVFIFRIMVLVAAAESVWGDEKSAFTCNTQQPGCGjb5_MOUSE MNWGFLQGILSGVNKYSTALGRIWLSVVFIFRVLVYVVAAEEVWDDDQKDFICNTKQPGCGjb5_RAT MNWGFLQGILSGVNKYSTALGRIWLSVVFIFRVLVYVVAAEEVWDDEQKDFICNTKQPGCGjb3_RAT MDWKKLQ

24、DLLSGVNQYSTAFGRIWLSVVFVFRVLVYVVAAERVWGDEQKDFDCNTRQPGCGjb3_MOUSE MDWKKLQDLLSGVNQYSTAFGRIWLSVVFVFRVLVYVVAAERVWGDEQKDFDCNTRQPGCGJB3_HUMAN MDWKTLQALLSGVNKYSTAFGRIWLSVVFVFRVLVYVVAAERVWGDEQKDFDCNTKQPGCconsensus *.* *.*.*.*.*.*.*.*.*.*. *.*. .*.*.*1of 5Human cx31 compare to other GJB proteinGJB3(connexin 3

25、1) was mapped to 1p33-35 by FISHGJB3(connexin 31) was mapped to 1p33-35 by FISH 定位在定位在1p33-p351p33-p35的疾病有常染色体显性遗传的疾病有常染色体显性遗传的感觉神经性耳聋（的感觉神经性耳聋（DFNA2DFNA2）、）、CMT2ACMT2A型的腓骨肌萎型的腓骨肌萎缩症、变异性红皮病和眼睑下垂。我们在中国遗传缩症、变异性红皮病和眼睑下垂。我们在中国遗传病家系收集数据库收集的神经性耳聋和腓骨肌萎缩病家系收集数据库收集的神经性耳聋和腓骨肌萎缩症的病人中检测突变，在两个高频听力减退的浙江症的病人中检测突变，

26、在两个高频听力减退的浙江家系和湖南家系中分别发现错义和无义突家系和湖南家系中分别发现错义和无义突 变的杂合变的杂合子，并选择了非相关的子，并选择了非相关的150150名个体进行检测，未检测名个体进行检测，未检测到错义和无义突变。到错义和无义突变。 同胞对连锁分析2.血缘一致性（IBD）等位基因共享：两个个体在一个STR标记位点显示出相同数目的重复次数，而且遗传自同一祖先1.状态一致性（IBS）等位基因共享：两个个体在一个STR标记位点显示出相同数目的重复次数a ba ca ca ca cb ca ca aa ba aIBD IBS 2 10 10 0 如果两个血缘相关个体表型类似，那么与此性状

27、相关的基因附近的遗传标记也应当类似，类似程度受多个因素的影响: 1.该位点对研究性状总的贡献多大2.影响到该性状的未知基因与待检测遗传标记的遗传距离关联研究关联研究关联指两个或多个事件之间具有统计学依赖性关联指两个或多个事件之间具有统计学依赖性等位基因关联：等位基因关联： 等位基因频率随疾病性状显著增高或降低等位基因频率随疾病性状显著增高或降低连锁不平衡：连锁不平衡： 紧密连锁而产生的等位基因关联紧密连锁而产生的等位基因关联当特定标记等位基因与疾病易感基因距离当特定标记等位基因与疾病易感基因距离很近，经过多代仍然共同传递，则人群中很近，经过多代仍然共同传递，则人群中受累的无血缘关系的个体可能享有共同的受累的无血缘关系的个体可能享有共同的等位基因。等位基因。关联研究常见类型关联研究常见类型1.1.病例病例对照研究：对照研究： 收集一组患者以及一组匹配的对照，收集一组患者以及一组匹配的对照，比较侯选位点等位基因频率是否存在显比较侯选位点等位基因频率是否存在显著性差异著性差异 病例对照研究不需要确认家庭单位，病例